热带假丝酵母1230 POX4、POX5基因及其编码蛋白的研究

根据GenBank中热带假丝酵母菌株pk2 3 3 (ATCC 2 0 3 3 6 )POX4和POX5基因序列 ,设计了两对引物。通过PCR扩增 ,用一种简易的方法克隆了 1 2 3 0菌株中这两个基因。对POX4、POX5的测序表明 ,1 2 3 0菌株的POX5基因与pk2 3 3菌株的POX5基因存在菌株间的差异。这种差异对蛋白功能的影响有待进一步研究。对POX4和POX5编码的蛋白PXP4、PXP5进行Pfam分析和二级结构预测后 。

耶氏酵母菌POX5基因的敲除

对于耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中编码与γ–癸内酯合成相关的乙酰辅酶A氧化酶基因(POX1-POX5)中的POX5基因用Cre/loxP同源重组系统进行敲除。设计含有60个核苷酸与POX5基因的ORF两侧序列同源的长引物,以pUG6为模板构建带有Cre/loxP系统的敲除组件,之后转化耶氏酵母YL(Yarrowia lipolytica),通过PCR确定阳性克隆子。将质粒pSH65转入阳性克隆子,半乳糖诱导表达Cre酶以切除KanMX基因并经过PCR确认。最后在YPD培养基中连续传代培养丢失pSH65质粒,成功获得POX5缺陷型菌株。