胰岛β细胞中PP2ACα基因失活小鼠模型的建立及初步表型分析

目的 :建立胰岛β细胞特异性失活PPACα基因小鼠模型,对其表型进行初步观察。方法 :通过Ins2-Cre小鼠与PP2ACα^(^(flox/flox))小鼠交配,获得胰岛β细胞特异性失活PP2ACα基因小鼠(PP2ACα^(flox/fIox):Ins2-Cre)。PCR和Western blot鉴定PP2ACα基因第二外显子敲除小鼠(KO)。4月龄时行腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT),以PP2ACα^(flox/flox)小鼠为对照。结果 :1PP2ACα转录本在KO小鼠短于对照小鼠;2KO小鼠胰岛中PP2AC蛋白水平较对照小鼠显著下降(P<0.05);3IPGTT结果显示:4月龄KO小鼠30、60、120 min时血糖明显高于对照小鼠(P<0.05)。结论:成功建立胰岛β细胞特异性失活PPACα基因小鼠模型,4月龄PP2ACα^(flox/fIox):Ins2-Cre小鼠糖耐量受损。

抑制PP2Acα促进胃癌进展中WTAP高表达

目的:探讨蛋白磷酸酶2A催化亚基Cα(PP2Acα)的抑制是否会影响胃癌细胞的恶性表型,以及维尔姆肿瘤1相关蛋白(Wilms’tumour 1-associating protein,WTAP)在这一进展中的表达。方法:使用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分别比较PP2Acα编码基因(PPP2CA)、WTAP基因在胃癌组织与正常胃黏膜组织中的表达量;使用KM-plot网站(http://kmplot.com/analysis/)分析PPP2CA、WTAP与胃癌预后的关系;使用慢病毒介导的短发卡RNA(short hairpin RNA,sh RNA)在胃癌细胞中敲减PPP2CA,从而抑制PP2Acα的表达;随后提取RNA、蛋白分别进行定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western blot),检测PPP2CA、WTAP的mRNA水平及蛋白的表达;最后在离体与活体层面观察抑制PP2Acα对于胃癌细胞恶性表型的影响。结果:抑制PP2Acα后,胃癌细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)形态改变,且增殖、迁移与侵袭能力均得到了增强,并伴随着WTAP蛋白及mRNA水平的显著升高。结论:抑制PP2Acɑ促进胃癌细胞的恶性表型,可能是通过上调WTAP的表达水平实现的。

水稻PP2Ac类磷酸酶蛋白质在盐胁迫下的表达

【目的】了解重要蛋白质的表达模式进而探讨水稻耐盐的分子机理。【方法】采用基于抗体的蛋白质组学策略,用免疫印迹(western blotting)调查了5个PP2Ac类磷酸酶蛋白质在苗期盐胁迫条件下的表达。【结果】发现在耐盐水稻品种兰胜中,OsPP2Ac-4的表达上调,在盐敏感的水稻品种9311中,OsPP2Ac-2、OsPP2Ac-3和OsPP2Ac-5的表达也发生了上调,但OsPP2Ac-4的表达下调。比较2个品种间PP2Ac蛋白质的表达,发现在正常生长条件下,PP2Ac蛋白质的表达没有显著区别且基本保持恒定,其表达变化仅发生在盐胁迫条件下。分析水稻MPSS数据库提供的苗期盐胁迫的转录数据,发现OsPP2Ac-2、OsPP2Ac-3和OsPP2Ac-5在盐胁迫条件下转录水平下调。【结论】发现了4个盐胁迫条件下表达发生变化的PP2Ac蛋白质。

降低蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)去甲基化促进巨噬细胞M1型分化

目的研究蛋白磷酸酶2A催化亚基C(PP2Ac)去甲基化在巨噬细胞M1型分化中的作用。方法 THP-1细胞经佛波酯(PMA)诱导分化为M0型巨噬细胞,再用脂多糖(LPS)、γ干扰素(IFN-γ)刺激48 h分化为M1型巨噬细胞;处理组和溶剂对照组在M1型巨噬细胞模型上,分别加入0. 5μmol/L ABL127和二甲基亚砜(DMSO)培养48 h。倒置显微镜观察细胞形态学变化,实时荧光定量PCR检测M1型巨噬细胞分化标志物环加氧酶2(COX-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和C-X-C趋化因子配体10(CXCL10)的mRNA水平,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能,Western blot法检测PP2Ac去甲基化水平。结果 M0型巨噬细胞分化为M1型巨噬细胞,细胞伸出伪足逐渐呈梭形,分化标志物COX-2、TNF-α、IL-6和CXCL10的mRNA水平明显升高,吞噬功能增强,PP2Ac去甲基化表达下降;处理组加入0. 5μmol/L ABL127,与溶剂对照组相比,PP2Ac去甲基化水平明显降低,梭形细胞增多,分化标志物COX-2、TNF-α、IL-6和CXCL10明显增高,吞噬功能增强。结论降低PP2Ac去甲基化能促进M1型巨噬细胞分化,并增强巨噬细胞促炎性细胞因子表达和吞噬功能。

PP2Ac去甲基化在锰暴露诱导大鼠肝脏炎症性损伤中的作用研究

目的:研究亚急性及慢性锰暴露对SD大鼠肝脏的损伤效应,探索PP2Ac去甲基化修饰在锰暴露致肝脏炎症性损伤中的作用。方法:40只雄性SD大鼠按体重随机入组,分别设置4周(4W)和16周(16W)两个暴露时间点,每个时间点分两组(即4W、16W对照组和4W、16W锰暴露组),每组10只;锰暴露组腹腔注射MnCl_(2)·4H_(2)O(15 mg/kg),对照组注射同体积的生理盐水,每天1次,持续4W、16W。实验终点时分离大鼠肝脏,ICP-MS法检测血液及肝组织中锰的含量。苏木精—伊红(HE)染色观察肝脏的病理改变。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测肝脏炎症相关因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、趋化因子CCL-2的表达。Western blotting法检测肝组织总PP2Ac、去甲基化PP2Ac及PP2Ac甲基化调控蛋白LCMT-1及PME-1的表达。结果:与4 W对照组相比,4 W、16 W锰暴露组全血锰含量显著升高(P<0.01),4 W锰暴露组肝组织锰含量显著下降(P<0.05),而16 W锰暴露组肝组织锰含量显著升高(P<0.01);HE染色结果显示,与4 W对照组相比,4 W锰暴露组出现肝血窦扩张,炎症细胞浸润,16 W锰暴露组与16 W对照组相比,肝索排列紊乱,细胞间隙增大,肝窦进一步扩张充血,大量肝细胞膜破裂;与4 W对照组相比,4 W锰暴露组仅肝脏炎症因子IL-6的表达呈上升趋势,16 W锰暴露组CCL-2、IL-6的mRNA表达与16 W对照组相比呈升高趋势,并且TNF-α的mRNA表达显著升高(P<0.05);4 W、16 W锰暴露组的去甲基化PP2Ac表达水平升高(P<0.05),仅16W锰暴露组的甲基化PP2Ac修饰蛋白LCMT-1表达水平降低(P<0.01),不同时点锰暴露组PME-1、总PP2Ac蛋白表达无明显变化。结论:锰诱导大鼠肝脏产生炎症性损伤,可能与上调肝脏PP2Ac去甲基化有关。

PP2Ac在人不同类型肺癌组织和肺癌细胞中的表达

目的研究PP2Ac在人不同类型肺癌组织和肺癌细胞中的表达.方法用免疫组化方法从组织水平上观测临床获取人不同类型肺癌标本组织的PP2Ac蛋白表达;用Western blot分子生物学方法从细胞水平上测定两种人肺癌细胞株(YTLMC-90和GLC-82)的PP2Ac和p-AKT蛋白表达.结果免疫组化结果显示:在人肺鳞癌、腺癌和小细胞肺癌三种肺癌组织中的PP2Ac蛋白表达与肺癌患者的性别、年龄和肿瘤分化程度均无明显相关性(P>0.05);在人肺鳞癌组织和小细胞肺癌组织细胞浆中均未见有PP2Ac蛋白表达,但在其间质有阳性表达;在人肺腺癌组织中PP2Ac蛋白呈阴性表达,而p-AKT蛋白却呈现强阳性表达.Western blot结果表明:在人正常肺组织细胞中PP2Ac蛋白呈正常表达;YTLMC-90细胞中PP2Ac蛋白较人正常肺组织表达稍弱,而在GLC-82细胞中表达明显减弱,甚至缺失;在人正常肺组织细胞中p-AKT蛋白呈低表达,给予GLC-82细胞加入PP2A抑制剂OA(岗田酸),在6 h、12 h、24 h的不同时间点,p-AKT蛋白的表达均较未加OA组明显增强,PP2Ac和p-AKT蛋白表达呈反相关.结论PP2Ac可能参与肺癌的发生,其表达水平可能与肺癌细胞病理类型有关.AKT的活化(p-AKT)可能与肺癌的发生发展密切相关.

PP2A Cα敲除小鼠心肌细胞模型的构建

体外构建PP2A Cα敲除的原代小鼠心室肌细胞模型.选择性地将雄性PP2A Cαfl/fl,Cre/-小鼠与雌性PP2ACαfl/fl,Cre/-小鼠交配.新生小鼠心脏经胰酶消化后差速贴壁获得原代小鼠心室肌细胞,用带有Cre的腺病毒侵染心肌细胞,经荧光显微镜观察和Western-blot检测,分析PP2A Cα的敲除效果.将基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的雌雄小鼠进行交配,得到其同样基因型的后代,进而可获得足量基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的原代小鼠心肌细胞.用带有重组酶Cre的腺病毒侵染细胞48 h后,可见带有绿色荧光的心肌细胞;Western-blot检测显示,PP2A Cα在Cre腺病毒侵染的心肌细胞可下调60%～80%.本研究成功建立了PP2A Cα敲除的原代小鼠心肌细胞模型.

菜蛾斑蝥素受体PP2A催化亚基基因的原核表达与纯化

为获得菜蛾斑蝥素受体PP2Ac蛋白,支持斑蝥素受体结合机理等相关研究,本试验以菜蛾cDNA为模板,利用PCR方法扩增得到菜蛾PP2Ac基因,将PP2Ac基因连接至经HindⅢ与BamH I双酶切处理的pET-30a原核表达栽体中,获得重组质粒并将其命名为pET30a-PX-PP2Ac。将pET30a-PX-PP2Ac转化至大肠杆茵BL21中进行诱导表达获得目的蛋白后,使用Ni-琼脂糖柱对重组蛋白进行纯化。结果表明,菜蛾PP2Ac基因可以在大肠杆菌中表达,目的蛋白在不同的温度下均以包涵体形式存在。优化后的诱导表达条件是IPTG浓度0.2 mM和温度30℃,目的蛋白大小约38 KD。

假体周围骨溶解中成骨细胞自噬的信号通路

背景:最近的证据表明,自噬作为一种细胞自我保护机制,在调节成骨细胞功能和维持成骨细胞稳态方面起着重要作用,其对假体周围骨溶解的治疗与预后存在重要影响。目的:通过总结既往关于成骨细胞自噬机制的研究,为假体周围骨质溶解提供新的治疗思路和潜在的治疗靶点。方法:由第一作者应用计算机检索2015-2022年出版的文献,以“磨损颗粒、假体周围骨溶解、成骨细胞、信号通路、自噬”等为中文检索词检索中国知网、万方和维普数据库;以“wear debris,wear particles,peri^(*)prosthetic osteolysis,PPOL,Aseptic loosening,osteoblast,OB,Signal path,autophagy”等为英文检索词检索PubMed和Web of Science数据库,按照入选标准最终共纳入98篇文章。结果与结论:(1)在假体周围骨溶解中,磨损颗粒诱导的成骨细胞自噬能力的改变对于疾病的发展及转归有着关键性的作用。(2)多种信号通路共同介导成骨细胞自噬的过程,其中关键通路包括AMPK/ULK1/mTOR、核转录因子κB及Pink1/Parkin等,AMPK,mTOR及ULK1三者能够相互调节,共同维持自噬水平的稳定,核转录因子κB通路与自噬之间存在复杂的串扰,PINK1及Parkin在受损线粒体膜表面聚积,诱导线粒体自噬。(3)多条信号通路之间存在串扰,相互影响下构成了复杂的自噬网络,且在不同细胞中,相同自噬通路的激活可能会带来截然不同的影响。(4)磨损颗粒诱导的适度的自噬会减少成骨细胞的凋亡,同时增强其分化及矿化能力,改善假体周围骨溶解的预后;反之,自噬激活的不足或过度都会对成骨细胞带来损害,推动骨溶解的进展;因此,通过药物或者基因靶向调控磨损颗粒诱导的成骨细胞自噬水平可能是假体周围骨溶解治疗的方向之一。

条件性敲除胰岛β细胞蛋白磷酸酶2Acα对小鼠糖代谢影响机制的探讨

目的探讨条件性敲除胰岛β细胞蛋白磷酸酶2Acα(PP2Acα)对小鼠血糖水平影响的机制。方法选取4月龄条件性敲除胰岛β细胞PP2Acα(KO组)及对照组(Con,与KO组同窝别、性别匹配)各24只。行腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT),测定0、30、60和120min小鼠血糖及胰岛素分泌水平;新鲜分离胰岛,用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(GSIS)评价小鼠胰岛β细胞对葡萄糖反应性。结果IPGTT结果显示,KO组葡萄糖负荷后30min血糖[(23.1±5.1)vs(17.5±5.7)mmol/L]和60min血糖[(20.5±6.8)vs(13.5±5.1)mmol/L]高于Con组(P<0.05);KO组葡萄糖负荷后30min血清胰岛素水平较Con组下降[(2.16±0.92)vs(1.07±0.42)μg/L](P<0.05);GSIS显示高糖刺激下KO组胰岛素分泌较Con组减少[(0.82±0.15)vs(0.42±0.24)μIU/L](P<0.05)。结论条件性失活胰岛β细胞PP2Acα小鼠糖耐量受损可能与胰岛素一相分泌受损相关。