‘金冠’苹果PP2C基因克隆及低温胁迫下的表达

【目的】为了鉴定并探究苹果MdPP2C基因对低温胁迫的响应机制。【方法】利用基因克隆技术,从苹果‘金冠’cDNA中克隆得到3个苹果MdPP2C基因,利用生物信息学技术对3个基因的理化性质、系统进化及保守基序等进行分析,并采用real time-qPCR技术检测其在4℃低温处理下的表达情况。【结果】序列分析结果表明,克隆得到的MdHAB1、MdHAI2和MdAHG3分别编码544、405和432个氨基酸,其预测的表观相对分子质量分别为58.26 kDa、44.29 kDa和45.80 kDa,理论等电点分别为5.03、6.63和5.01,均属于酸性蛋白;3个蛋白均属于不稳定蛋白和亲水蛋白,3个蛋白均无跨膜结构,主要定位于细胞核和叶绿体,且3个基因编码的氨基酸序列均具有PP2C超家族保守结构域;real time-qPCR结果表明,低温处理后,MdHAB1、MdHAI2和MdAHG3转录水平均呈现持续上调的趋势。【结论】从‘金冠’中克隆的3个PP2C家族基因均参与苹果‘金冠’对低温胁迫的响应,以上结果为探究苹果PP2C家族基因在苹果属植物对低温胁迫的响应过程及调控机制提供理论基础,为使用分子育种手段培育苹果耐寒性砧木提供新的基因。

辣椒PP2C家族基因鉴定与响应低温胁迫的表达分析

对辣椒PP2C基因家族成员进行全基因组鉴定和特征分析,并研究CaPP2Cs基因在低温胁迫下的表达模式,结果表明:在辣椒参考基因组共系统鉴定出99个CaPP2Cs基因家族成员,并不均匀地分布在12条染色体上,CaPP2Cs基因编码的氨基酸数介于99~1 572 aa,分子量介于10.94~178.40 Da,等电点介于4.08~9.51。系统进化树分析可将辣椒和拟南芥的PP2C基因分为13个亚族,每个亚族均含有辣椒PP2C基因,基因结构分析表明CaPP2Cs基因的外显子数量介于1~18;在CaPP2Cs基因的启动子中发现许多与光、低温和激素响应有关的顺式作用元件。转录组数据分析表明,CaPP2C31基因在叶片中的表达量显著高于其他基因,CaPP2C16则特异性地表达于授粉后50 d的胎座中。低温处理24 h时,CaPP2C97和CaPP2C3在叶片中呈现显著的下调表达;低温处理1 h时,CaPP2C36、CaPP2C5、CaPP2C53、CaPP2C43、CaPP2C99等基因在根中明显上调,CaPP2C19、CaPP2C23、CaPP2C44、CaPP2C95则显著下调,表明CaPP2Cs可能在辣椒响应低温胁迫中发挥作用。

谷子PP2C基因家族的特性

PP2Cs(2C type protein phosphatases)是一种单体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在真核生物中,PP2Cs在脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)等激素信号传导途径中起着重要的调控作用。本研究通过序列比对,从谷子基因组中筛选出80个PP2C候选基因,聚类分析将其分为12个亚族(A、B、C、D、E1、E2、F1、F2、G、H、I、J)。与拟南芥PP2C基因家族比对表明,A^I为2个物种共有的亚族,J亚族只存在于谷子基因组中,L亚族只存在于拟南芥中。将谷子A亚族的10个成员命名为SiPP2CA1-10。基因表达谱分析表明,A亚族基因不同程度受ABA、干旱、高盐、低温和低氮诱导表达,其中,SiPP2CA6、SiPP2CA8在5种处理下诱导表达量都高。对10个A亚族成员的启动子分析发现,在这些基因的启动子序列中含有多种参与逆境胁迫应答的顺式作用元件,其中,SiPP2CA5、SiPP2CA6、SiPP2CA7、SiPP2CA8的启动子中含有参与低氮胁迫响应的元件。进一步研究发现,SiPP2CA8主要在根部表达,且在低氮胁迫下一直有较高的表达水平。亚细胞定位结果显示SiPP2CA8定位在细胞膜、细胞质、细胞核中;双分子荧光互补试验(BiFC)结果表明,SiPP2CA8与一个ABA受体类似蛋白SiRCAR3(基因号为Si018317m.g)在细胞膜、细胞质及细胞核上互作,表明SiPP2CA8在谷子中可能参与ABA信号传导过程。

耐盐杜梨蛋白磷酸酶基因PbPP2C的克隆及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)是植物体内脱落酸ABA信号传导关键负调控酶,在植物耐非生物胁迫中发挥着重要的作用。本研究利用RT-PCR技术,克隆出编码杜梨PP2C蛋白的基因Pb PP2C,其核苷酸序列全长1 353 bp,开放阅读框长1 263 bp,编码422个氨基酸残基,这些残基中包括了与二价金属离子结合的MED、DGH、DG和D结构域。系统发生分析结果表明,该氨基酸与拟南芥AHG3亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明:盐胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中的表达12 h达到峰值,同时在根中72 h达到第二个峰值;干旱胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中表达72 h达到峰值。说明Pb PP2C与杜梨耐盐和耐干旱胁迫存在紧密关联。

小麦TaPP2C59基因的克隆及表达分析

2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是ABA信号途径的关键组分,在ABA信号转导及植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。为给TaPP2C59基因功能的研究奠定基础,同时为小麦对非生物胁迫应答的信号转导机理研究提供参考,本研究从小麦中克隆了第一个PP2C基因TaPP2C59,并对其在逆境胁迫以及多种信号分子处理下的表达模式进行研究。序列分析表明,该基因开放阅读框(ORF)为855bp,编码284个氨基酸。进化树分析表明,该基因编码的蛋白与水稻OsPP2C45蛋白和拟南芥AtPP2C59蛋白的亲缘关系最近。多序列比对分析表明,TaPP2C59具有PP2C家族蛋白的保守结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受ABA、低温和高盐胁迫抑制。因此,可以推测TaPP2C59可能作为负调控因子参与ABA信号及非生物逆境胁迫应答。

枳PP2C基因家族的鉴定及表达分析

【目的】鉴定枳(Poncirus trifoliata)PP2C基因家族,并分析其在不同组织的表达模式以及对低温、高温和干旱胁迫的响应。【方法】利用生物信息学方法在枳基因组中鉴定PP2C基因家族,分析其理化性质、染色体定位、系统进化、基因结构、保守基序、基因复制及启动子顺式作用元件等,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法检测PtrPP2C基因家族成员在不同非生物胁迫处理下的表达情况。【结果】枳中共鉴定出可聚类为10个亚族的53个PP2C基因,命名为PtrPP2C1~PtrPP2C53,其编码蛋白的氨基酸数介于235~1184 aa之间,分子质量为25.90~127.95 ku;这些基因分布于枳的10条染色体上,均具有保守的PP2C蛋白结构域。PtrPP2Cs启动子上存在大量的植物激素、胁迫响应以及生长发育相关的顺式作用元件。转录组数据分析结果显示,不同组织中PtrPP2Cs的相对表达量存在明显差异,总体上分为特异性表达和普遍性表达。qRT-PCR结果显示,在低温、高温和干旱胁迫处理条件下的12 h内,与对照相比分别有10、8和9个基因均持续上调表达;其中,PtrPP2C29较明显,其在(4±1)℃低温处理下的相对表达量是对照的56.8倍,在(38.0±0.5)℃高温处理下的相对表达量与对照相比显著上调,是对照的195.1倍,在干旱处理条件下的相对表达量是对照的5.1倍。【结论】从枳基因组中鉴定出53个PP2C基因家族成员,具有明显的组织表达特异性,并参与多种非生物胁迫应答。研究结果为进一步探究枳PP2C基因家族提供了参考。

巴西橡胶树6个PP2C家族基因成员分子信息学与抗旱功能分析

PP2C是一类丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶,在高等植物ABA信号途径中起着重要的作用。为阐明巴西橡胶树中PP2C基因的结构与功能,本研究通过生物信息学方法,从橡胶树转录组数据库中鉴定并获得6个PP2C家族基因,均含有PP2CD、F1和F2亚族。通过qRT-PCR技术对6个PP2C家族基因进行了干旱处理下的差异表达分析,发现6个基因都不同程度上响应橡胶树干旱胁迫。本研究为探究PP2C基因在橡胶树抗干旱反应机制提供了理论依据。

甜瓜PP2C基因家族的鉴定和生物信息学分析

PP2C是一类对生物体具有重要调控作用的蛋白磷酸酶。为研究其在甜瓜生长发育过程中的功能,本研究利用生物信息学方法对甜瓜中PP2C基因家族进行了分析。结果表明,在甜瓜基因组中共包含有61个PP2C基因家族成员,分为11个亚族。motif和基因结构分析结果显示在同一亚家族内,CmPP2C基因的基因结构与motif具有较高的相似性。基因复制事件分析结果表明,片段重复事件是CmPP2C基因家族扩张的主要原因,且CmPP2C基因成员在进化过程中可能经历了严格的纯化选择。表达分析结果显示CmPP2C基因在甜瓜不同组织内呈不均匀分布,有些基因表现出显著的组织特异性。此外,启动子分析结果表明在CmPP2C基因启动子序列中分布有多个植物激素和逆境相关的响应元件。本研究为甜瓜PP2C基因家族生物学功能的研究提供一定的参考。

拟南芥磷酸酶基因亚细胞定位与组织表达

通过克隆拟南芥磷酸酶PP2C家族基因At3g51370,构建了绿色荧光蛋白融合表达载体,用基因枪将构建好的载体轰击洋葱表皮细胞进行瞬时表达分析,发现该At3g51370基因表达蛋白定位在细胞核中;用实时定量PCR方法分析At3g51370基因的组织表达特性,发现该基因在花器官中的表达量明显高于其它组织.进一步构建了含At3g51370基因的启动子和GUS报告基因的植物表达载体,经农杆菌介导转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,分析该启动子在不同生长时期与不同组织中的转录活性,结果发现,在幼苗期At3g51370基因主要集中在根尖分生组织和顶端分生组织表达,在成年植株中则集中在生殖器官如花和果荚柄等部位表达,在光照和黑暗条件下,At3g51370基因的表达特性没有明显差异.研究表明,At3g51370可能与其它核定位的PP2C磷酸酶一样参与了基因表达的调控,可能在拟南芥早期发育阶段的细胞增值分裂相关信号转导途径中发挥功能,并在花器官的发育过程中行使功能,且不参与光信号转导.

花生蛋白磷酸酶2C家族基因的鉴定和盐胁迫响应分析

为了分析花生中蛋白磷酸酶2C基因(PP2C)的情况,对耐盐花生突变体(S2)和对照(S4)在胁迫处理前后的叶片进行RNA-Seq分析。通过生物信息学分析筛选出了79个具有完整开放阅读框的PP2C基因,它们位于花生A组野生种的10条染色体上,不同染色体上的PP2C基因数目差异很大,分布为1~15个。根据拟南芥中的PP2C基因的聚类分析结果,79个花生PP2C基因能聚到已报道的12个亚族15个亚类。为了分析这些PP2C基因对盐胁迫响应情况,利用突变体S2和对照S4构建了盐胁迫处理前后的表达谱,筛选出35个受盐胁迫诱导表达的PP2 C基因,涉及12个亚族14个亚类,其中A亚族b亚类、G亚族b亚类、I亚族、L亚族所有成员均受盐胁迫诱导表达;而G亚族a亚类的所有成员均不受盐胁迫诱导表达。对这35个PP2C基因的启动子研究发现,绝大多数PP2C基因的启动子存在多种胁迫响应元件:如与高温胁迫相关的调控元件HSE、与干旱诱导相关的MYB转录因子结合位点MBS、逆境胁迫应答元件TC-rich repeats、与抗氧化反应相关的ARE元件等。为花生PP2C基因的功能研究和利用奠定了基础。

甘蔗割手密PP2C基因家族的全基因组鉴定与表达分析

作为ABA信号通路的重要调控因子, 2C型蛋白磷酸酶(protein phosphatase 2Cs, PP2Cs)在植物生长发育过程、激素信号传导以及环境胁迫响应中发挥着关键作用,然而目前关于甘蔗PP2C基因家族的系统分析还未见报道。本研究利用生物信息学手段在甘蔗割手密(Saccharum spontaneum)基因组中共鉴定获得包含等位基因在内的183个PP2C基因,其中89个单倍型代表性PP2C基因。Ss PP2Cs基因不均匀分布在甘蔗割手密所有染色体上,全基因组复制或片段复制是驱动甘蔗PP2C基因家族扩张的主要方式;甘蔗与其他模式植物PP2C共线性基因间的K_(a)/K_(s)值均小于1,表明其在进化过程中经历了较强的纯化选择。对代表性Ss PP2Cs基因的分析表明,基于系统发育关系将Ss PP2Cs家族蛋白分为11个组,大多数Ss PP2Cs蛋白表现出相似的保守基序分布模式,而基因结构存在较大差异;Ss PP2Cs基因的启动子顺式调控元件主要涉及植物激素调节、环境胁迫响应和植物生长发育调控等;Ss PP2Cs基因在甘蔗不同生长阶段、连续发育梯度的叶片以及昼夜节律变化中呈现出不同的时空表达模式;37个Ss PP2Cs基因在模拟干旱胁迫诱导下显著差异表达,暗示其在干旱胁迫响应中发挥重要作用;此外通过蛋白质互作网络预测挖掘了Ss PP2Cs潜在的关键互作蛋白。该研究结果为推进甘蔗PP2C基因家族的功能研究奠定基础,以期为甘蔗的抗旱分子育种提供候选基因。

‘月月粉’月季PP2C家族基因鉴定及非生物胁迫响应分析

利用生物信息方法从月季‘月月粉’(Rosa chinensis‘Old Blush’)基因组中共鉴定出69个PP2C家族成员,其编码氨基酸的长度在122~1082 aa之间,等电点介于4.03~9.34,大部分蛋白呈亲水性。系统进化树分析将其分为12个亚族,同一亚族内基因结构和保守基序具有较高的相似性。基因片段复制事件是PP2C家族基因扩张的主要原因。启动子顺式作用元件分析表明约85%的月季PP2C含有逆境应答元件、激素应答元件等,推测其在响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用。月季PP2C基因的表达具有组织和发育时期特异性,且部分基因参与干旱和高温胁迫响应过程,其中3个A亚族基因在干旱胁迫中响应明显,1个A亚族基因和2个G亚族基因在高温胁迫中响应明显。通过qRT-PCR分析11个不同亚族PP2C基因在月季失水胁迫和ABA处理下的表达模式,发现6个A亚族基因(RC0G0099200、RC1G0458700、RC1G0569200、RC2G0066800、RC2G0089100和RC5G0571100)和1个G亚族基因(RC3G0083700)的表达量显著升高,表明这些基因可能受ABA诱导并参与植物失水胁迫响应。

割手密2C型蛋白磷酸酶ScPP2C基因的克隆与表达分析

割手密由于具有抗病、抗虫、抗逆等潜在的有利基因,历来被用于甘蔗的抗性遗传改良。在割手密中克隆编码2C型蛋白磷酸酶(protein phosphatase 2C, PP2C)的基因,并分析其在干旱胁迫下的差异表达。本研究利用RT-PCR方法从割手密叶片中克隆得到PP2C基因的CDS全长序列,利用生物信息学在线软件对PP2C蛋白的理化性质、蛋白结构进行预测分析,并采用实时荧光定量的方法分析该基因在不同干旱处理下的差异表达。结果显示从割手密中克隆到一个全长951 bp编码316个氨基酸的2C型蛋白磷酸酶基因,命名为ScPP2C,GenBank登录号为MG322120。荧光定量分析表明,随着干旱胁迫时间的延长,其表达量呈先上调后下调的表达模式,说明该基因是干旱胁迫诱导型基因。本研究通过挖掘甘蔗野生种割手密中的抗旱新基因ScPP2C,为甘蔗野生种质资源开发利用、转基因抗旱甘蔗新品种的选育提供了参考依据。

肺炎链球菌phpP基因重组表达及其产物PP2C型磷酸酶活性的研究

目的：构建肺炎链球菌StkP／PhpP信号偶联中磷酸酶编码基因phpP原核表达系统，了解表达产物rPhpP磷酸酶活性及类型。方法采用PCR扩增肺炎链球菌ATCC6306株phpP基因并测序。采用常规基因工程技术构建phpP基因原核表达系统。采用SDS-PAGE及凝胶图像分析系统检查rPhpP表达情况及其可溶性，Ni-NTA亲和层析法提纯rPhpP。实时荧光定量RT-PCR检测亚致死量青霉素和头孢噻肟药物作用后phpP基因转录水平变化。采用专业生物信息学软件分析phpP基因序列中磷酸酶功能结构域及其类型。采用丝／苏氨酸磷酸酶检测试剂盒检测rPhpP水解PP2C型磷酸酶活性并测定其酶动力学参数。结果克隆的phpP基因序列与GenBank报道序列完全相同。所构建的phpP基因原核表达系统表达可溶性rPhpP。亚致死量青霉素和头孢噻肟药物作用后phpP-mRNA水平升高。 phpP基因序列中含有PP2Cc磷酸酶结构功能域。提纯的rPhpP能水解PP2C型磷酸酶底物磷酸肽[RRA（pT）VA]且活性随rPhpP浓度增加而升高，其Km 和Kcat值分别为277．35μmol／L和0．71 S－1。结论肺炎链球菌phpP基因表达产物为PP2C型磷酸酶，亚致死量青霉素和头孢噻肟可诱导phpP基因表达上调。

葡萄PP2C家族基因的鉴定与表达分析

参考拟南芥(Arabidopsis thaliana)的PP2C基因注册序列,从葡萄(Vitis vinifera)全基因组中鉴定得到PP2C家族基因27个,分为10个亚族A、C^I、K、L。编码氨基酸181~1 084个,理论等电点4.46~8.98。亚细胞定位分析表明,葡萄PP2C基因家族主要在细胞质、叶绿体和细胞核中表达。二级结构主要以α–螺旋和不规则卷曲为主。葡萄PP2C基因芯片表达谱分析发现,该家族成员在葡萄不同组织中响应不同的逆境胁迫。qRT-PCR分析表明,葡萄试管苗在100和50 mmol·L^(-1) ABA、10% NaCl和10%PEG单独处理6 h后VvPP2C02的诱导表达量最高,分别是对照的11倍、8倍、14倍和13倍。

工业大麻PP2C基因家族成员鉴定及表达分析

目的:2C类蛋白磷酸酶(PP2C)参与植物多种信号转导途径。其通过负调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路参与植物多种胁迫响应和代谢产物合成的调控。对工业大麻PP2C(CsPP2Cs)基因家族进行全基因组鉴定及表达分析,以期为研究CsPP2Cs在工业大麻生长发育过程中的生物学功能提供参考。方法:利用MEGA-X构建系统发育树,利用ExPASy、WoLF PSORT、MEME、Batch-CD-Search、PlantCare、TBtools分别对CsPP2Cs蛋白理化性质、亚细胞定位、保守基序、蛋白结构域、CsPP2Cs基因启动子顺式作用元件和与拟南芥PP2Cs(AtPP2Cs)基因的共线性进行预测和分析。通过转录组数据和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)对CsPP2Cs基因表达进行分析和验证。结果:从工业大麻全基因组中共鉴定出52个具有保守结构域的PP2Cs,基因编码蛋白长度244~1089个氨基酸不等,相对分子质量在26.76~122.53 kDa,亚细胞定位主要分布于细胞核、细胞质和叶绿体。系统进化树将52个CsPP2Cs分为10个亚族和5个未分组成员。共线性分析发现,工业大麻与拟南芥存在7对同源基因。顺式元件预测显示光响应元件和脱落酸元件居多。基因表达热图显示,相同基因在各组织中存在差异表达。对部分基因进行Real-time PCR验证,进一步证实了转录组数据的准确性。同时,可变剪切分析表明部分CsPP2Cs基因在进化过程中存在可变剪切本。结论:从全基因组层面对CsPP2Cs进行了分析和预测,提示CsPP2Cs可能广泛参与工业大麻的多种生物学过程,为进一步研究CsPP2Cs功能奠定了基础。

中间锦鸡儿CiPP2C8-like基因的克隆及表达分析

蛋白磷酸酶PP2C作为调节因子直接或间接调控逆境胁迫信号途径和生长发育过程。本研究从已构建好的抑制性消减文库(SSH)中获得1条PP2C基因序列,对其进行了克隆。测序表明该基因c DNA长为999 bp,共编码333个氨基酸,推导该蛋白分子量为36.12 k D,等电点为6.71,是一种亲水蛋白。经氨基酸序列比对和进化树分析表明,该基因属于PP2C家族成员,并命名为Ci PP2C8-like。实时荧光定量PCR检测表明中间锦鸡儿Ci PP2C8-like基因表达受盐和脱水胁迫诱导。

‘鄞红’葡萄PP2C基因的克隆与生物信息学分析

PP2C是一类重要的蛋白磷酸酶,广泛参与各种逆境胁迫响应。为了了解PP2C基因在植物体内发挥的特殊功能,以‘鄞红’葡萄为材料,利用RT-PCR等技术克隆了全长,并对该基因进行生物信息学分析。结果显示,PP2C基因全长为1522 bp,其中开放阅读框(ORF)长度为1512 bp,编码506个氨基酸。通过多种软件比对分析,‘鄞红’葡萄与柑橘(Citrus sinensis)、樱桃李(Prunus avium)、草莓(Fragaria vesca)、黄瓜(Cucumis melo)的相似性高达95%以上,亲缘关系较近。该结果为进一步研究‘鄞红’葡萄PP2C蛋白功能以及揭示该蛋白在植物响应非生物胁迫过程中发挥的作用提供了一定基础。

割手密蛋白磷酸酶基因SsPP2C1的克隆及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)是植物体内脱落酸ABA信号传导关键负调控酶,在植物耐非生物胁迫中发挥着重要的作用。为探讨抗旱割手密材料中蛋白磷酸酶基因的序列及其表达特征,利用转录组测序数据,结合RT-PCR技术,克隆出编码割手密PP2C蛋白的基因,命名为SsPP2C1,其核苷酸序列编码区长855 bp,编码284个氨基酸残基,这些残基中包括了与二价金属离子结合的MED、DGH、DG和D结构域。系统发生分析结果表明,该氨基酸与谷子Sipp2c亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明在干旱协迫条件下,SsPP2C1基因主要在割手密的叶片中表达,在根和茎中的表达量相对较低;该基因在割手密伸长期表达量最高,成熟期次之,苗期最小;随着胁迫时间的延长,该基因的表达量显著升高,在胁迫6 d时达到最大值,为对照的4 940.27倍,随后显著下降,表明SsPP2c1基因与割手密抗旱性存在紧密关联。