CMVpp65基因修饰的树突状细胞刺激自身T细胞活化

巨细胞病毒(CMV)感染易发生于慢性移植物抗宿主病(cGVHD)患者,其特异性免疫依赖于T细胞活性。本研究探讨CMV pp65基因修饰的树突状细胞(DC)对自身T细胞的活化作用。采用具有高效转染非分裂细胞的慢病毒系统将CMV全长pp65基因导入鼠源性DC;采用CpG-DNA诱导DC细胞成熟;采用流式细胞术及免疫荧光方法测定T淋巴细胞抗原及IFNγ表达。结果表明:慢病毒感染DC的感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50,最佳感染效率可达30%-40%;表达pp65基因的成熟DC能刺激自身naiveT细胞表达CD69;表达PP65蛋白的成熟DC能够刺激自身CD4+或CD8+T细胞分泌IFNγ。结论:pp65基因修饰、CpG-DNA诱导成熟的DC能体外激活CMV特异性T淋巴细胞。

人巨细胞病毒截短被膜磷蛋白pp65的原核表达及抗原性分析

目的利用大肠杆菌表达系统表达截短人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白,并对其抗原性进行初步鉴定。方法采用PCR扩增HCMV pp65基因961～1 686 bp(321aa-562aa)片段,并将其插入表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)菌株,十二烷基硫酸钠—聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析蛋白表达,常规镍柱法纯化目的蛋白,以ELISA法初步检测其抗原性。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,pp65抗原和全病毒抗原的P/N值分别为2.737、2.535。结论本研究成功表达截短HCMV pp65抗原,并证实其蛋白抗原性优于全病毒抗原;此为HCMV检测试剂盒的研制和疫苗的研究提供了依据。

人巨细胞病毒pp65蛋白的原核表达及活性鉴定

以病毒全基因组为模板,通过PCR技术扩增HCMV pp65基因编码序列,其产物连接到pMD18-T质粒,酶切并回收目的片段后克隆到表达载体pTO-T7,然后将重组质粒pTO-T7-pp65转化大肠杆菌ER2566,大量表达后将重组蛋白进行质谱法分析鉴定,再利用Western blot以及间接ELISA进行重组蛋白的活性及抗原性鉴定.结果显示:通过SDS-PAGE鉴定可知,大肠杆菌可能表达出了重组蛋白,质谱分析结果说明了重组蛋白为pp65蛋白,具有极高可信度,其相对分子质量约为63 kD,从Western blot和间接ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)的结果可知,pp65蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性与免疫原性,为制备相应的抗原诊断单克隆抗体打下了基础,同时也为开发HCMV IgG快速诊断ELISA试剂盒提供了可选原料.

人巨细胞病毒蛋白IE1及pp65在HEL细胞中表达的时空特性

目的 研究HCMV感染HEL细胞后，病毒蛋白IE1及pp65在不同时间点的亚细胞分布及其表达量-时效变化相关性。方法 HCMV感染HEL细胞后，吸附2h，维持培养0、2、4、6、10、22及46h后，用病毒蛋白IE1的单克隆抗体及蛋白pp65的单克隆抗体做免疫细胞化学染色，检测此两种蛋白的胞内分布；同时运用图像分析系统对此检测结果进行灰度值测定，并利用方差分析分析此测定结果。结果 IE1蛋白仅在核内检测到；表达趋势是：4～6hp．i．呈表达上升趋势，6～8hp．i．又下降。pp65首先于仅在核内被检测到，之后也分布于胞浆中。pp65表达于2～8hp．i．表达增多，8～24hp．i．呈胞内稳定表达，24-48hp．i．表达降低。结论 IE1蛋白及pp65表达的亚细胞分布具有时空特异性；两种蛋白的表达量上都表现为量-时效相关性；本研究间接反映了病毒复制增殖的连续过程。

重组人巨细胞病毒pp65蛋白与金叶败毒颗粒联合抗人巨细胞病毒效应

目的比较重组人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白与中药金叶败毒颗粒的抗HCMV作用并探讨二者间的关系。方法用重组HCMVpp65蛋白刺激培养的人外周血单个核细胞,制备HCMV抗原特异性细胞毒T细胞,即pp65-CTL。分别将pp65-CTL、金叶败毒颗粒、pp65-CTL+金叶败毒颗粒、更昔洛韦作用于HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(HEL),比较各组对HEL细胞病变的抑制作用,同时用RT-PCR法半定量检测作用前和作用不同时间点HCMVmRNA表达水平的变化。结果pp65-CTL组在HEL细胞感染后72h才开始出现少许细胞病变,有显著抗HCMV作用;pp65-CTL+金叶败毒颗粒组作用不同时间点对HCMVmRNA表达及HCMV所致细胞病变的抑制作用明显强于单一用药。结论重组HCMVpp65蛋白刺激培养的pp65-CTL对HCMV有明显的抑制作用,与中药金叶败毒颗粒有显著的协同作用,可共同应用于HCMV活动性感染的治疗。

人巨细胞病毒pp65蛋白基因的克隆及表达

目的 构建人巨细胞病毒pp6 5蛋白全长基因的原核表达载体 ,并对表达产物进行纯化。方法 PCR扩增pp6 5的全长基因 ,将其插入到原核表达载体 pRSET ,在工程菌BDPS中进行IPTG诱导表达 ,采用Westenblot进行鉴定并通过亲和层析对表达产物进行纯化。结果 成功构建了全长HCMVpp6 5的原核表达载体并诱导其高效表达 ,用镍离子柱亲和层析获取纯度达 90 %以上的表达蛋白。结论 我们获取的HCMVpp6 5原核表达蛋白纯度较高 ,可将其应用于免疫治疗和临床检测的进一步研究。

人巨细胞病毒gH和PP65蛋白的B、T细胞优势抗原表位预测

目的利用生物信息学方法分析预测人巨细胞病毒(HCMV)膜表面糖蛋白gH以及磷酸化蛋白65(PP65)的B细胞、T细胞优势抗原表位,为HCMV亚单位疫苗的研发提供理论依据。方法从美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中获取HCMV的gH和PP65蛋白的氨基酸序列。通过ABCpred、BCPred和BepiPred软件预测gH和PP65蛋白的B细胞优势抗原表位;利用NetMHCⅡ2.3 Server和NetMHCⅡpan 4.0 Server软件预测gH和PP65蛋白的CD4^(+)T细胞优势抗原表位;使用NetMHC 4.0 Server和IEDB软件预测gH和PP65蛋白的CD8^(+)T细胞优势抗原表位;最后由VaxiJen v.2.0 Server软件对上述得到的所有抗原表位进行抗原性分析。结果gH和PP65蛋白的二级结构中无规卷曲均占比最高,分别为40.51%、52.94%;综合所有软件的预测结果并进行抗原性分析后,获得gH蛋白CD8^(+)T细胞优势抗原表位20个,CD4^(+)T细胞优势抗原表位15个,B细胞优势抗原表位1个,获得PP65蛋白CD8^(+)T细胞优势抗原表位8个,CD4^(+)T细胞优势抗原表位8个,B细胞优势抗原表位3个。结论HCMV的gH和PP65蛋白均含有丰富的B、T细胞优势抗原表位,可为HCMV亚单位疫苗的抗原肽选择提供理论依据。

人巨细胞病毒_(gp)52蛋白与_(pp)65蛋白融合表达及初步应用

为提高HCMVIgM抗体检测试剂盒的敏感性及特异性,本研究重组表达了HCMV糖蛋白gp52与磷蛋白pp65的嵌合抗原。从病毒及质粒中分别扩增gp52(氨基酸181～333,f_1)及pp65(氨基酸261～373,f_2)两个片段,以不同酶切位点插入到pTrcHis B载体上,筛选正确的重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白rp52～65。SDS-PAGE结果显示表达蛋白占菌体总蛋白的30％,以包涵体的形式存在,分子量为35000。以金属鳌合亲和层析(IMAC)及分子筛方法纯化表达蛋白,纯度达到96％,回收率为25.2％。以间接法检测HCMV IgM阳性血清,敏感性达到90.4％(19/21),证明此融合蛋白具有良好的抗原性,可作为HCMV IgM抗体检测试剂盒的包被抗原。

人巨细胞病毒感染在颅咽管瘤中的表达及意义

目的检测人巨细胞病毒(HCMV)感染在颅咽管瘤组织中的表达,探讨HCMV感染与颅咽管瘤发生的病因学关系。方法采用免疫组化方法检测HCMV立刻早期蛋白1-72(IE1-72)和磷酸化糖蛋白65(pp65)抗原在89例颅咽管瘤组织及10例正常脑组织中的表达情况。结果在颅咽管瘤组织中HCMV IE1-72和pp65抗原表达阳性率分别为77.5%和84.3%,而在正常脑组织中两抗原均为阴性,IE1-72和pp65抗原表达阳性率在颅咽管瘤组织和正常脑组织间均有显著性差异(P=0.000,P=0.000)。IE1-72抗原在牙釉质型和鳞状乳头型颅咽管瘤组织中阳性率分别为83.6%和67.6%,pp65抗原分别为89.1%和76.5%;两抗原在牙釉质型颅咽管瘤组织中的阳性率均略高于鳞状乳头型,但均无统计学差异(P=0.135,P=0.197)。结论 HCMV IE1-72和pp65抗原在颅咽管瘤组织中均有高表达,而在正常脑组织中无表达,HCMV感染及其抗原表达可能与颅咽管瘤的发生有一定关系,其致病机制尚需进一步研究。

人巨细胞病毒蛋白pp65诱导特异性免疫应答的研究

目的研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)蛋白pp65(HCMV pp65)蛋白对特异性免疫应答的诱导作用。方法采用T细胞体外激活试验检测重组HCMVpp65蛋白对人外周血单个核细胞(perpheral blood mononuclear cells,PBMC)的刺激作用,并对激活的淋巴细胞进行传代培养,观察细胞的增殖;收集传代增殖的淋巴细胞,检测其对受HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibro-blasts,HEL)的杀伤作用和对受感染后不同时段的HEL的杀伤功能。结果重组HCMV pp65蛋白在体外能激活PBMC,并使激活的细胞增殖;增殖的淋巴细胞可特异性地杀伤受HCMV感染的HEL细胞,但对未受感染的HEL细胞无杀伤作用,且其对受染2h后的HEL即有杀伤作用。结论重组HCMV pp65蛋白可诱导CD8+T细胞的激活与增殖,对受HCMV感染细胞产生特异性的杀伤作用,此作用不需要病毒转录和蛋白合成,对于HCMV的免疫治疗将有重要的作用。

5′-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷标记人巨细胞病毒感染SD大鼠脑组织神经元模型的建立

目的用5′-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记的人巨细胞病毒（HCMV）进行脑内定位注射，建立SD大鼠脑组织感染模型；研究大鼠脑组织海马部位神经元对HCMV的容许性及HCMV在其内的感染特点。方法运用BrdU标记HCMV基因组，并测定病毒滴度。将21只SD大鼠随机分为病毒感染组（n=18）及对照组（n=3），病毒感染组根据感染时间分为感染24、48及96h组。每个感染时间组再分为2μl及4μl两个剂量组，每个剂量组包括3只动物，均以脑内注射途径将BrdU标记的HCMV直接注入大脑海马部位；对照组大鼠注射不含病毒的细胞培养上清液（4μl）。感染大鼠术后分笼饲养，于各感染时间点处理大鼠取脑组织，冰冻切片；对海马周围部位脑组织分别运用抗BrdU及抗微管相关蛋白2（MAP-2）抗体进行免疫荧光双标染色检测标记病毒；抗pp65抗体免疫组化染色及Nissil复染检测病毒蛋白pp65。结果病毒感染后24h，两个剂量组均未在神经元内检测到标记病毒及pp65。病毒感染后48h和96h，两个剂量组在海马部位神经元中均检测到了标记病毒阳性荧光及pp65的阳性着色；而且2μl组的受感染神经元细胞数较4μl组少，但同一剂量组在48h和96h受感染神经元细胞数未见明显变化。结论成功建立了BrdU标记HCMV感染SD大鼠啮组织的模型。大鼠脑组织海马部位神经元是HCMV的半容许细胞，HCMV在其内仅表现为潜伏性感染。

人巨细胞病毒抗原表位的重组表达及免疫原性分析

目的:用大肠杆菌表达系统表达人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白和gB蛋白的优势抗原表位基因,制成HCMV亚单位疫苗,探究其在Balb/c小鼠体内的体液免疫和细胞免疫活性。方法:选取pp65蛋白的490~508aa和gB蛋白的607~621aa的基因片段,经PCR扩增目的片段,连接表达载体pET-32a(+),转化BL21(DE3)plys菌株,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)分析蛋白质表达,金属螯合亲和镍柱法纯化目的蛋白。重组蛋白免疫Balb/c小鼠,Western blotting法和间接ELISA法检测重组蛋白的体液免疫活性;通过流式细胞仪和双抗夹心ELISA法检测重组蛋白的细胞免疫活性。结果:获得分子质量约为22kDa的融合蛋白,Western blotting检测显示抗体有特异性,间接ELISA法检测其效价为1∶102 400。与对照组相比,实验组小鼠外周血中CD4^+T细胞和CD8^+T细胞的数量,以及IFN-γ、IL-2、IL-12的含量有显著提高(P<0.01)。结论:制备的具有免疫优势抗原表位的重组蛋白能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫反应。