携带16 kD抗原多肽的PP7噬菌体样颗粒的制备及其对结核病诊断的价值评估

目的获得表面展示有16kD抗原多肽(16kD91-110)的PP7噬菌体样颗粒(bacteriophage-like particle,BLPs),并评价其在结核病诊断中的价值。方法用普通PCR技术扩增出含16kD91-110多肽编码基因的PP7衣壳蛋白基因,将其插入到pETDuet-2PP7载体中,获得pETDuet-2PP7-16kD91-110质粒;将上述重组质粒转化大肠埃希菌,诱导表达产物用SDS-PAGE和western blot进行鉴定;将纯化的2PP7-16kD91-110作为刺激抗原,用ELISA间接法检测结核病患者血清中的16kD抗体水平。结果SDS-PAGE及电镜结果显示成功表达2PP7-16kD91-110BLPs,并且展示于PP7 BLPs表面的16kD91-110多肽表位能特异性与抗16kD抗体结合;对活动性肺结核和潜伏性肺结核患者,以2PP7-16kD91-110BLPs为刺激抗原的全血释放γ干扰素试验的敏感性分别为75%和82.9%,与北京万泰结核分枝杆菌相关γ干扰素释放试剂盒相比,差异无统计学意义。结论成功制备表面展示有16kD91-110多肽的PP7 BLPs,为应用γ干扰素释放试验检测结核分枝杆菌提供了一种安全性高、稳定性好、价格低廉的刺激抗原,为结核病的诊断提供一种新的思路。

表面展示有前列腺酸性磷酸酶多肽(PAP_(114-128))的PP7噬菌体样颗粒的制备及其活性验证

目的获得表面展示有前列腺酸性磷酸酶多肽片段(PAP_(114-128))的PP7噬菌体样颗粒,并证实其保留原有的生物活性。方法用基因突变和重叠PCR技术扩增出PP7衣壳蛋白单链二聚体(简称为2PP7)基因,将其插入到载体p ETDuet-1中,获得质粒p ETDuet-2PP7,然后通过普通PCR获得携带有PAP_(114-128)编码基因的PP7衣壳蛋白基因,将其插入到质粒p ETDuet-2PP7中,获得质粒p ETDuet-2PP7-PAP_(114-128);将上述重组质粒转化大肠杆菌,诱导表达产物用SDS-PAGE、双向免疫扩散以及ELISA进行鉴定。结果以ExTaq DNA聚合酶行重叠PCR可获得2PP7基因,其表达产物衣壳蛋白单链二聚体与野生型PP7噬菌体衣壳蛋白的抗原性相同;展示于PP7噬菌体样颗粒表面的PAP_(114-128)表位与天然的人PAP蛋白相应表位无异,且能诱导较高水平的抗体产生。结论含重复序列的2PP7基因可通过将基因突变和重叠PCR技术联用获得,且以其为基础成功制备表面展示有PAP114-128的PP7噬菌体样颗粒,不仅可解决多肽不稳定的问题,也为研究多肽的递送及功能奠定基础。