PPARγ配体结合域的表达、纯化和鉴定

提取MCF 7乳腺癌细胞的总RNA ,通过RT PCR技术扩增出hPPARγ/LBDcDNA ,并克隆于载体pGEX 1γT上 ,测序表明该序列与已报道序列相同 ,将其转入BL2 1(DE3)大肠杆菌中 ,IPTG诱导表达GST hPPARγ/LBD ,在不同培养温度或IPTG诱导浓度下 ,GST hPPARγ/LBD以可溶或包涵体形式存在 ,表达产物经谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析纯化 ,可被抗hPPARγ多克隆抗体特异识别 。

铜绿假单胞菌信号分子3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD的结合特性研究

目的制备纯化的人过氧化物酶体增殖物激活受体-配体结合域(PPARγ-LBD)肽段并观察铜绿假单胞菌信号分子N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-O-C_(12)-HSL)与PPARγ-LBD的结合强度。方法采用分子对接的方式预测3-O-C_(12)-HSL与PPARγ的结合位点。合成PPARγ-LBD基因序列并插入pET28b质粒,鉴定后通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组肽段,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot分析。表面等离子体共振技术检测3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD的结合动力学参数。结果分子对接结果显示3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD区的Tyr473和Tyr327形成氢键,3-O-C_(12)-HSL末端柔性碳链与PPARγ-LBD区的Met329、Leu330等残基形成疏水结合。制备获得人PPARγ-LBD肽段,经SDS-PAGE及Western blot检测在25~35 ku有一条蛋白的印迹,与PPARγ-LBD分子质量一致。3-O-C_(12)-HSL与PPARγ结合的亲和力常数为1.65×10^(-4) mol/L,结合速率常数为1.06×10^(2)/ms,解离速率常数为1.75×10^(-2)/s。结论3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD功能区结合能力强于PPARγ特异性拮抗剂GW9662,为制备针对3-O-C_(12)-HSL的特异性靶向药物提供了实验依据。