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Evolution of PE35 and PPE68 Gene Families in Mycobacterium: Roles of Horizontal Gene Transfer and Evolutionary Constraints
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作者 Ashay Bavishi Lin Lin +1 位作者 Madhusudan Choudhary Todd P. Primm 《Journal of Tuberculosis Research》 2014年第4期181-198,共18页
Mycobacterium is a genus of bacteria with over a hundred non-pathogenic and pathogenic species, best recognized for certain members known to cause diseases such as tuberculosis and leprosy. Two novel protein families ... Mycobacterium is a genus of bacteria with over a hundred non-pathogenic and pathogenic species, best recognized for certain members known to cause diseases such as tuberculosis and leprosy. Two novel protein families important in the pathogenesis of Mycobacterium species are the PE and PPE families. These two protein families affect the antigenic profiles, disturbing host immunity. To better understand the origin and evolution of these gene families and the differences in their composition between pathogenic and non-pathogenic strains, several bioinformatic analyses were conducted both among Mycobacterium and closely related species that contain PE35 and PPE68 gene homologs. The methods included protein homology searches (BLASTP), horizontal gene transfer analysis (IslandViewer), phylogenetic analysis, gene cluster analysis and structural and functional constraints. Results revealed that PE and PPE gene homologs were not only limited to Mycobacterium, but also existed in three other non-mycobacterial genera, Rhodococcus, Tsukamurella and Segniliparus, and were possibly initially acquired from non-mycobacterial microorganisms by multiple horizontal gene transfers. Results also demonstrated that PE and PPE genes were more diverse and more rapidly evolving in pathogenic Mycobacterium as compared with non-pathogenic Mycobacterium and other non-mycobacterial species. These findings possibly shed light on the diverse functions and origins of the PE/PPE proteins among these organisms. 展开更多
关键词 PE35 ppe68 HORIZONTAL gene TRANSFER MYCOBACTERIUM
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结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化
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作者 陈曦 张宗德 +7 位作者 古淑香 贾红彦 刘忠泉 邢爱英 李自慧 杜博平 黄海荣 马玙 《结核病与胸部肿瘤》 2007年第1期6-12,共7页
目的构建结核分枝杆菌(M.tb)rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增MTB rv3873基因,并克隆入pGEM-T Easy质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5α和B... 目的构建结核分枝杆菌(M.tb)rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增MTB rv3873基因,并克隆入pGEM-T Easy质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后,经0.4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,pET30a(+):rv3873表达出分子量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50%,Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化,获得纯度为90%的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a(+):rv3873,并获得PPE68重组蛋白,为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 rv3873基因 ppe68重组蛋白
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结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化 被引量:2
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作者 佘茜 徐蕾 +3 位作者 何永林 靳志栋 张丹 杨春 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第12期1295-1298,共4页
目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(D... 目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ppe68 原核细胞 基因表达 纯化
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结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒的构建及表达 被引量:1
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作者 董志玲 何永林 +5 位作者 徐蕾 王静娴 张壮苗 杨静 冯鑫 杨春 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第4期469-472,共4页
目的构建结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,采用PCR法分别扩增CFP10和PPE68基因,基因拼接法扩增CFP10-PPE68融合基因,克隆至pET-32a(+)载体,构建重... 目的构建结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,采用PCR法分别扩增CFP10和PPE68基因,基因拼接法扩增CFP10-PPE68融合基因,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-PPE68,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-PPE68经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量为68 630,表达量为菌体总蛋白的41.8%,主要以可溶性形式存在,且可与PPE68 rBCG免疫兔血清发生特异性反应。结论成功构建了结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了融合蛋白,为其在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 培养滤液蛋白10 戊糖-5-磷酸.3-差向异构酶68 融合基因 原核细胞 基因表达
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PPE68基因重组卡介苗的构建及其免疫原性
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作者 王静娴 徐蕾 +4 位作者 何永林 张壮苗 董志玲 冯鑫 杨春 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第6期665-668,675,共5页
目的构建携带结核分枝杆菌PPE68基因的重组卡介苗(BCG),并检测其诱导小鼠的免疫应答情况。方法将带有分枝杆菌复制子OriM的穿梭质粒pBudCE4.1/PPE68/OriM电转化入BCG中,PCR鉴定重组BCG。用鉴定正确的PPE68/OriM重组BCG免疫BALB/c小鼠,每... 目的构建携带结核分枝杆菌PPE68基因的重组卡介苗(BCG),并检测其诱导小鼠的免疫应答情况。方法将带有分枝杆菌复制子OriM的穿梭质粒pBudCE4.1/PPE68/OriM电转化入BCG中,PCR鉴定重组BCG。用鉴定正确的PPE68/OriM重组BCG免疫BALB/c小鼠,每2周免疫1次,共3次,末次免疫后2周采血,分离血清,检测血清中IgG2a、IFNγ和IL-12水平;取脾、肺,分离脾淋巴细胞,检测经特异性蛋白刺激后淋巴细胞的增殖水平;进行脾CD4+和CD8+T淋巴细胞计数,计算CD4+/CD8+比值;检测脾、肺荷菌量并观察组织病理变化。结果 PPE68/OriM重组BCG经PCR鉴定构建正确;其免疫小鼠后,可诱导小鼠血清中IgG2a、IFNγ和IL-12水平显著增加(P<0.05),脾淋巴细胞增殖显著(P<0.05),CD4+和CD8+T细胞百分比增加,CD4+/CD8+T细胞比值降低,脾、肺均无菌落生长且未见明显病理改变。结论成功构建了PPE68基因重组BCG,其免疫BALB/c小鼠能明显提高小鼠的Th1型免疫效应,有利于机体抗结核菌感染。 展开更多
关键词 ppe68基因 结核分枝杆菌 卡介苗 免疫应答
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