Pax-8-PPAR-γ融合蛋白PPFP在甲状腺癌中的研究进展

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在逐年增加。多数甲状腺癌发生与基因突变相关，如BRAF基因第15外显子上第1799位核苷酸T-A的转换，即密码子600的突变， Ras基因的突变， RET基因融合以及 Pax-8-PPAR-γ融合基因。

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的构建含人PAX8／PPARγ融合基因（PPFP）基因重组慢病毒载体并检测其表达性能。方法从已构建好的含PPFP的质粒克隆模板PEGFP—C—PPFP中，利用聚合酶链反应（PCR）方法钓取目的基因PPFP，将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC—FU（含Flag基因）中，得到重组的pGC—FU—PPFP，通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后，将pGC—FU—PPFP质粒和包装质粒pHelper1．0、pHelper2．0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞，获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒，收集并浓缩病毒上清液，测定重组病毒的滴度。通过Western blot鉴定PPFP—Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的基因在靶细胞中的表达。结果经PCR扩增获得2591bp的目的基因片段，构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确；该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3．5×10^7转导单位TU／ml；感染的293T细胞，Western blot结果显示条带大小为90KDr，可判断目的基因PPFP在293T细胞中表达。结论成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC—FU—PPFP，并建立慢病毒过表达系统。

PPFP基因促进人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1增殖和迁徙运动能力的体外实验研究

目的:研究PPFP基因对人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1生物学特性的影响,以明确PPFP是否具有致瘤作用。方法以我们前期实验构建的PPFP基因慢病毒载体稳定转染细胞株Nthy-ori 3-1PPFP、空白慢病毒载体稳定转染细胞株Nthy-ori 3-1Vector和未转染细胞株Nthy-ori 3-1为研究对象,以MTT法检测细胞增殖情况,平板克隆形成实验检测克隆形成数,软琼脂集落形成实验检测集落形成率,划痕愈合实验观察各组细胞体外迁徙运动能力,流式细胞仪检测各组细胞凋亡和细胞周期。结果以Nthy-ori 3-1Vector组和Nthy-ori 3-1组细胞为对照组,Nthy-ori 3-1PPFP组细胞较对照组在细胞增殖能力、平板克隆形成数、软琼脂集落形成率、体外迁徙运动能力均明显提高或增强,而细胞凋亡率明显下降,G0/G1期细胞明显减少,S期及G2/M期细胞则显著增加。结论PPFP基因可显著促进人正常甲状腺细胞Nthyori 3-1的增殖能力,并显著抑制其凋亡和促进其迁徙运动能力,提示该基因可能在滤泡状甲状腺癌恶性增殖和侵袭转移过程中起关键性作用。

PPFP基因转染人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1前后的蛋白质组学研究

目的 :采用蛋白质组学技术检测转染致瘤基因PPFP前后人正常甲状腺Nthy-ori 3-1细胞中蛋白质组分的改变,筛选PPFP基因调控的蛋白,以期为寻找甲状腺滤泡状癌(follicular thyroid carcinoma,FTC)的标志性蛋白或新的药物靶标蛋白提供线索。方法 :收集Nthy-ori 3-1、Nthy-ori 3-1vector和Nthy-ori 3-1PPFP细胞,提取细胞总蛋白,采用二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)制备3组细胞的总蛋白2-DE图谱;应用PDQuest软件对2-DE图谱进行比较分析,寻找差异表达的蛋白质点;采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-l ight tandem mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析技术对这些差异表达的蛋白质进行鉴定,并选取其中MALDI-TOF-MS鉴定分数较高、覆盖率较大且认为与FTC发生和发展关系较为密切的5种蛋白[prohibitin、半乳糖凝集素1(galectin-1)、细胞角蛋白8(cytokeratin 8)、cytokeratin 19和热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)]作为验证对象,采用蛋白质印迹法检测各蛋白在3组细胞中的表达水平。结果 :采用2-DE技术建立了Nthy-ori 3-1、Nthy-ori 3-1vector和Nthy-ori 3-1PPFP 3组细胞的2-DE图谱。应用PDQuest软件分析发现,Nthy-ori 3-1PPFP细胞与亲本Nthy-ori 3-1细胞及空载体Nthy-ori3-1vector细胞中差异在2倍以上的蛋白质斑点有38个,采用MALDI-TOF-MS质谱分析技术结合数据库搜索,共鉴定出了28个差异蛋白质点。Nthy-ori 3-1PPFP细胞与2个对照组相比,表达上调的点有19个,表达下调的点有9个。蛋白质印迹法检测结果与蛋白质组学研究结果完全一致。结论 :PPFP基因转染Nthy-ori 3-1细胞后共筛选获得28个差异表达的蛋白,这些差异表达的蛋白可能是PPFP基因调控的蛋白,为进一步阐明FTC发生和发展的分子机制奠定了基础。