PPP5C对人肺腺癌H1299细胞迁移侵袭及肿瘤干性的影响及机制研究

目的探讨磷酸蛋白磷酸酶催化亚基(PPP5C)对人肺腺癌H1299细胞迁移侵袭能力及肿瘤干性的影响及机制。方法构建PPP5C-pcDNA3.1过表达载体,转染PPP5C-pcDNA3.1和pcDNA3.1至H1299细胞,遗传霉素(G418)筛选H1299稳转细胞系。qRT-PCR和Western blot法鉴定PPP5C mRNA和蛋白的表达水平,细胞生长曲线绘制和克隆形成实验检测细胞增殖活性;划痕和Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力;诱导干细胞成球实验检测细胞干性。结果成功构建PPP5C-pcDNA3.1真核表达载体,转染H1299细胞后PPP5C的表达水平显著升高。H1299细胞过表达PPP5C后,生长曲线和克隆形成实验结果显示细胞增殖能力无变化;划痕和Transwell实验显示细胞迁移和侵袭能力显著增强,基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达升高;干细胞成球结果显示细胞干性显著增强,性别决定区Y-box 2(SOX2)的表达升高。结论人肺腺癌细胞H1299中过表达PPP5C不影响细胞增殖,但可通过调控MMP9和SOX2来增强其迁移侵袭能力及肿瘤干性。

敲除PPP5C对肝癌细胞生长影响的研究

目的探讨丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶5(PPP5C)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)进展过程中所发挥的作用。方法采用实时PCR技术分析人类六个不同HCC细胞系中PPP5C的表达水平,使用慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)抑制PPP5C在HCC细胞系Hep G2和Bel-7404中的表达,观察PPP5C在HCC细胞的增殖、克隆的形成及周期的进展方面所起到的作用。结果在慢病毒短发夹PPP5C感染的细胞中,PPP5C的信使RNA水平有显著下降。在PPP5C降低之后,HCC细胞的增殖和克隆形成能力都严重受损。此外,细胞周期分析显示PPP5C降低后,Hep G2细胞在G0/G1阶段和G2/M阶段被抑制。结论 PPP5C能够在HCC细胞中表达,而PPP5C的降低能够抑制HCC细胞的增殖、克隆的形成及周期的进展。RNAi导致的PPP5C下降对于HCC的治疗可能是一种潜在的新型治疗策略。

NCTD通过调控PPP5C影响人白血病细胞增殖和凋亡的机制研究

目的研究去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)通过调控磷酸蛋白磷酸酶催化亚基5C(protein phosphatase 5 catalytic subunit,PPP5C)对人白血病NB4、K562细胞增殖、凋亡能力的影响及机制的初步研究。方法体外培养NB4、K562细胞,电转PC3.1和PPP5C-PC3.1质粒至NB4、K562细胞,遗传霉素(geneticin,G418)筛选NB4、K562稳转细胞系。Western blot和RT-qPCR实验检测PPP5C蛋白和mRNA表达水平。采用CCK-8、迁移实验、Live&Dead^(TM)动物细胞活力/毒性检测试剂盒分别检测NB4、K562细胞的增殖能力、迁移能力和死细胞、活细胞的数量。将NB4、K562稳转细胞分为0μg/mL NCTD组和不同浓度NCTD组,分别用含有0、8、16、32μg/mL NCTD的1640培养基培养;Live&Dead^(TM)动物细胞活力/毒性检测试剂盒检测死细胞率并对细胞形态进行拍照;Western blot检测各组细胞caspase 3、Cleaved caspase 3、JNK、p-JNK、p38、p-p38和α-Tubulin蛋白表达水平。结果NB4、K562细胞转染后PPP5C表达水平显著提高,细胞增殖能力、迁移能力、抗凋亡能力显著增强;与0μg/mL NCTD组相比,NCTD各浓度组会促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性;PPP5C过表达拮抗NCTD对白血病细胞的杀伤作用;机制研究发现PPP5C通过去磷酸化修饰降低p-JNK的蛋白水平进而调控与细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase 3的表达。结论NCTD能够通过调控PPP5C分子促进NB4、K562细胞凋亡,抑制细胞的增殖。

桃果实PpOAT和PpP5CS的克隆及其对外源GABA处理的响应表达

利用RT PCR结合RACE技术从‘玉露'桃果实中克隆得到△~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸转氨酶(OAT)基因的全长cDNA序列,分别命名为PpP5CS和PpOAT(GenBank登录号分别为KP973954和KP973956)。PpP5CS全长2511bp,开放阅读框为2 151 bp,编码717个氨基酸组成的蛋白质多肽,5'-UTR长度为123 bp,3'-UTR序列长度为235 bp;PpOAT全长1686 bp,开放阅读框1416 bp,编码472个氨基酸,5'-UTR长度为151 bp,3'-UTR序列长度为119 bp。进化树分析发现,PpOAT和PpP5CS与湖北海棠的同源性最高,与MhOAT和MhP5CS的相似性分别达到88%和91%。采用荧光定量PCR分析了外源5 mmol·L^(-1)GABA处理对桃果实0℃贮藏期间果实冷害发生和内源脯氨酸合成关键基因PpOAT和PpP5CS表达的影响。结果表明,GABA处理能显著抑制‘玉露'桃果实0℃贮藏期间果肉出汁率的下降,减轻冷害。通过上调果实中PpOAT和PpP5CS的表达,提高内源脯氨酸的合成和积累,进而增强了果实抵抗低温胁迫的能力,可能是外源GABA处理减轻桃果实冷害的重要原因。

Ppp5c和TTC16基因的TPR结构域与Hsp70、Hsp90蛋白的相互作用及对细胞周期的影响

目的:研究Ppp5c及TTC16基因的TPR(tetratricopeptide repeat)结构域短片段和Hsp70及Hsp90家族蛋白的相互做用,及其过表达对细胞周期的影响。方法:通过生物信息学的分析及PCR的方法,克隆Ppp5c及TTC16基因的TPR结构域以及HSPA1A、HSP90AA1的全长基因,并连入酵母双杂交载体,通过ClonTech的酵母双杂交实验体系研究蛋白和蛋白之间的相互作用。把Ppp5c及TTC16基因的TPR结构域克隆入真核表达载体,构架稳定表达Ppp5c及TTC16基因的TPR结构域的MCF-7细胞系,并通过流式细胞实验观察细胞周期。结果:Ppp5c及TTC16基因的TPR结构域能与HSPA1A或HSP90AA1发生相互作用。Ppp5c及TTC16基因的TPR结构域在MCF-7中的过表达能严重影响细胞周期,引起细胞凋亡和S期阻滞。结论:本实验初步揭示了不同蛋白的TPR结构域在与Hsp70及Hsp90蛋白的相互作用性质的异同点以及其过表达对细胞周期的影响,为全面理解TPR结构域的功能、Ppp5c以及TTC16蛋白在细胞内的功能奠定了前期实验基础。

PPP2R5C基因结构特点和生物学功能

PPP2R5C是蛋白磷酸酶2A的调节性亚单位中一个家族成员,它在调节细胞增殖、分化和转化等方面具有重要作用,其作用主要通过对P53蛋白某些位点氨基酸的去磷酸化而实现。近期研究提示,PPP2R5C基因表达模式的改变与细胞恶性转化相关;此外,有研究发现PPP2R5C可以作为B-CLL病情进展的相关标记。本文就PPP2R5C基因结构、生物学功能及PPP2R5C基因与肿瘤发生发展的关系进行了探讨。

PPP2R5C转录本在正常人和血液肿瘤病人中的分布情况

目的:建立分析不同PPP2R5C转录本检测方法,分析正常人和血液肿瘤病人中5种PPP2R5C基因转录本的表达特点。方法:根据PPP2R5C基因的结构特点,设计4对引物,利用RT-PCR方法分析9例正常人、7例T细胞-非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)、11例B细胞-急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和8例急性髓细胞白血病(AML)病人外周血单个核细胞(PBMC)中PPP2R5C基因的表达情况。结果:所设计的4对引物,均可在样本中扩增到预期PCR产物,其中第1对引物可扩增两个不同大小PCR产物(包含12+13+14外显子的大片段及仅含12+14外显子的小片段),而另3对对引物所扩增的产物分别为10+11+12+12 a外显子,Ⅲ+2外显子和Ⅳ+2外显子的基因片段,所有PCR产物均通过核苷酸序列分析证实。结果显示所有样本均表达全部PPP2R5C转录本。结论:初步建立区分不同PPP2R5C转录本的方法,各转录本在正常人和不同血液肿瘤病人中的分布情况基本一致。

下调PPP2R5C表达对Jurkat细胞GSK-3β、MDM2、pTEN、TP53通路相关调控基因表达谱的影响

目的利用基因芯片技术研究RNA干扰下调PPP2R5C对Jurkat细胞中GSK-3β、MDM2、pTEN、TP53通路相关基因表达的影响。方法利用核转染技术将PPP2R5C-si RNA799转导Jurkat细胞,培养48 h后,提取细胞总RNA,纯化m RNA后反转录制备目标序列,与Affymetrix基因表达谱芯片3’IVT杂交,以Affymetrix Gene Chip Scanner 3000扫描仪扫描得到原始图像数据,并应用Gene Spring GX 11.0软件进行差异表达谱分析。结果基因芯片分析GSK-3β、MDM2、pTEN、TP53信号通路相关的47个基因,发现全部基因发生了差异表达,其中上调基因有22个,下调基因有25个。明显上调的基因有SNAI1、APC、CDKN1A、ATM、MDM2和pTEN,而明显下调的基因只有GSK-3β。结论下调Jurkat细胞PPP2R5C基因时,在一定程度上选择性调节涉及细胞增殖和凋亡相关的GSK-3β、MDM2、pTEN和TP53信号通路基因的表达,从而抑制Jurkat细胞增殖。

下调PPP2R5C表达对Jurkat细胞TAL1相关调控基因表达谱影响的初步分析

目的:前期研究显示,下调PPP2R5C表达能抑制T细胞白血病细胞株Jurkat细胞增殖。本研究利用基因芯片技术分析RNA干扰下调PPP2R5C表达对Jurkat细胞中TAL1通路相关基因的影响。方法:利用核转染技术将PPP2R5C-siRNA799转导Jurkat细胞,培养48 h后,提取细胞总RNA,纯化mRNA后逆转录制备目标序列,与Affymetrix基因表达谱芯片3'IVT杂交,以Affymetrix Gene Chip Scanner 3000扫描仪扫描得到原始图像数据,并应用Gene spring GX 11.0软件进行差异表达谱分析。结果:基因芯片分析的TAL1信号通路相关的26个基因全部发生了差异表达,其中上调表达的基因有15个,下调表达的基因有11个;明显上调表达的基因有GATA1、TCF4、XRCC6和TCF3,而明显下调表达的基因有SIN3A和RUNX1。结论:下调Jurkat细胞PPP2R5C基因表达,在一定程度上能抑制TAL1信号通路基因,从而抑制Jurkat细胞增殖。

PPP2R5C与儿童急性T淋巴细胞白血病Molt-4细胞活性及Hsp90-GR信号关系的研究

目的:探讨PPP2R5C对儿童急性T淋巴细胞白血病Molt-4细胞活性的影响及其相关机制。方法:通过靶向PPP2R5C基因的小干扰RNA(si RNA)技术下调Molt-4细胞中PPP2R5C的表达,同时设置空白对照组、阴性对照组及17-DMAG组,其中阴性对照组转染si RNA-NC,17-DMAG组使用终浓度为6.4μmol/L的热休克蛋白90(HSP90)抑制剂17-DMAG处理细胞48 h,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测转染效率;CCK-8法检测各组细胞增殖活性,Ed U检测各组细胞增殖水平,流式细胞术检测各组细胞周期分布比例,Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡,RT-q PCR和Western blot检测各组细胞中HSP90和糖皮质激素受体(GR)的表达变化。结果:Molt-4细胞转染si RNA-PPP2R5C后,细胞中PPP2R5C m RNA与蛋白表达均明显下调,与空白对照组和si-NC组相比有显著性差异(P<0.05);相比空白对照组和si-NC组,si RNA-PPP2R5C组和17-DMAG组细胞的增殖活性明显降低(P<0.05),Ed U阳性细胞率明显减少(P<0.05),G1期细胞比例减少而G2期细胞比例增加(P<0.05),细胞凋亡率也明显增加(P<0.05);此外,si RNA-PPP2R5C组细胞中,PPP2R5C m RNA与蛋白表达较空白对照组和si-NC组明显下调(P<0.05),17-DMAG组细胞中PPP2R5C m RNA与蛋白表达较空白对照组和si-NC组也明显下调(P<0.05)。结论:下调PPP2R5C基因表达可抑制儿童急性T淋巴细胞白血病Molt-4细胞的活性,使细胞发生G2期阻滞,并促进细胞凋亡,其机制可能与抑制Hsp90-GR信号途径相关。

下调PPP2R5C表达对K562细胞TP53相关通路基因表达的影响

目的:利用基因芯片技术研究RNA干扰下调PPP2R5C对K562细胞中TP53通路相关基因表达的影响。方法:Affymetrix U133 plus 2.0基因表达谱芯片检测核转染PPP2R5C-siRNA991和SC对照组的K562细胞,应用Genespring GX 11.0软件分析差异基因相关信号通路变化情况。结果:基因芯片分析TP53信号通路紧密相关的22个基因,发现全部基因发生了差异表达,其中上调基因有8个,下调基因有14个。明显上调的基因有EP300、CCND1、BRCA2和USP7,而明显下调的基因则有MDM4、ESR1、ATM、CDK2、CDKN1A、TP53和CDKN2A。结论:下调K562细胞PPP2R5C基因时,在一定程度上选择性调节与细胞增殖密切相关的TP53信号通路相关基因的表达,从而抑制K562细胞增殖,促进了K562细胞凋亡。

RNA干扰下调PPP2R5C对T-ALL TCR Vβ亚家族分布和克隆增殖的影响

目的:基于前期利用靶向PPP2R5C基因的小干扰RNA(PPP2R5C-siRNA)抑制白血病T细胞增殖的结果,进一步了解PPP2R5C-siRNA对T-ALL样本中TCR Vβ亚家族基因谱系及其克隆性增殖情况.方法:利用PPP2R5C-siRNA转染2例初发未治疗T-ALL病人外周血单个核细胞(PBMC),设无关序列对照组(SC)和空白对照组(NC);利用实时定量PCR检测PPP2R5C基因表达水平.利用RT-PCR扩增各组样本中24个TCR Vβ亚家族基因的互补决定区3(CDR3);阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,了解其Vβ亚家族T细胞克隆性.结果:PPP2R5C-siRNA处理后明显下调PBMC中PPP2R5C基因表达水平.2例初发T-ALL外周血中分别可检测到10和17个Vβ亚家族,多数Vβ亚家族T细胞为多克隆性,病例1中Vβ9和Vβ17为寡克隆性,而病例2中,Vβ14和Vβ16呈寡克隆性;经过RNA干扰处理后,TCR Vβ亚家族表达率降低,仅检测到3和4个Vβ亚家族,分别为Vβ2,Vβ3,Vβ16和Vβ17.其中2个Vβ家族的寡克隆性模式发生改变,病例1中,Vβ17转为多克隆,而病例2中,Vβ16也转变为多克隆.结论:RNA干扰下调白血病T细胞PPP2R5C基因表达抑制细胞增殖时,在一定程度上影响TCR Vβ亚家族T细胞增殖和克隆模式变化,对正常T细胞功能可能存在一定影响.

PPP2R5C小干扰RNA的安全性分析

目的探讨PPP2R5C小干扰RNA的安全性。方法利用原子力显微镜观察转染PPP2R5C小干扰RNA 72 h K562细胞株干扰组、空转组及阴性对照组间微观形态学变化;利用荧光实时定量PCR检测K562细胞株组、健康人骨髓单个核细胞组、转染PPP2R5C-siRNA的健康人骨髓单个核细胞组及空转的健康人骨髓单个核细胞组的PPP2R5C基因表达量;利用甲基纤维素半固体培养方法分析PPP2R5C小干扰RNA作用后,对转染组(siRNA)及空转组(MOCK)的健康人骨髓单个核细胞体外分化及增殖能力的影响。结果转染PPP2R5C小干扰RNA 72 h K562细胞株各组间在细胞高度和半径上的差异无统计学意义(P> 0. 05); 3例健康人骨髓单个核细胞中的PPP2R5C基因表达明显低于K562,差异有统计学意义(P <0. 05);转染前后骨髓单个核细胞中PPP2R5C基因表达量无明显变化。PPP2R5C-siRNA转染、种板后14 d,健康人骨髓单个核细胞体外BFU-E、CFU-GM、CFU-Meg的形成与MOCK对照组比较差异无统计学意义(P=0. 723、0. 826、0. 448)。结论 PPP2R5C小干扰RNA对健康人骨髓单个核细胞的体外增殖和分化无显著影响,初步说明其安全性。

下调PPP2R5C诱导K562细胞凋亡过程中肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体及调控基因表达水平的研究

目的：在前期研究显示下调PPP2R5C抑制慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞增殖基础上，利用基因芯片技术研究RNA干扰下调PPP2R5C对K562细胞中肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）通路相关基因表达的影响。方法利用核转染沉默K562细胞株中PPP2R5C基因，培养48 h后，提取细胞RNA，经质控合格后进行Affymetrix基因表达谱芯片分析，并应用Genespring GX 11.0软件对TRAIL信号通路相关的21个基因进行差异表达谱分析。结果基因芯片分析发现全部基因存在表达差异，其中上调基因有8个，下调基因有13个。明显上调的基因有FASLG、TNFSF11和RIPK1，而明显下调的基因有CFLAR、TNFRSF10B、TRAF2、TNFRSF10D、TNFRSF10C、TNF和CASP10。结论下调K562细胞PPP2R5C基因时，在一定程度上涉及对TRAIL信号通路基因的抑制，从而抑制了K562细胞增殖，促进了K562细胞凋亡。