PPtase高表达菌株Streptomyces ghanaensis的发酵及其产物cytoxazone的发现

天然产物是新药发现的重要源泉。然而,由于大多数天然产物的生物合成途径在实验室培养的情况下处于沉默状态,因此需要对其生物合成调控环节进行干预,从而使微生物激活其自身的生物合成。在前期工作中,本研究发展了一种高效激活沉默天然产物的方法。通过在微生物体内过表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase,PPtase),可以高效激活一系列沉默天然产物的生物合成。基于该工作基础,本研究从一株PPTase过表达的嘎纳链霉菌Streptomyces ghanaensis CGMCC4.1967中,发现了一个新的激活天然产物。经分离后通过结构鉴定该产物为Th2细胞Ⅱ型细胞因子细胞特异性抑制剂cytoxazone。Cytoxazone此前是在一株分离自广岛的链霉菌(S/reptomyces sp.)的发酵液中发现,其在嘎纳链霉菌中为首次发现。本研究的结果证实了S.ghanaensis CGMCC4.1967可以产生cytoxazone。这部分工作将对阐明此类重要天然产物的生物合成机制,并对其进行合成生物学改造以获得更好活性的细胞因子抑制剂建立基础。

新靶点PPTase抗真菌药物的研究进展

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase,PPTase)可修饰脂肪酸合成酶、聚酮合成酶和非核糖体多肽合成酶复合体中的载体蛋白,使其由无活性形式转变成活性形式,同时它参与脂肪酸、聚酮、非核糖体多肽的合成,因而可作为抗菌药物有效的且颇具研究价值的新靶点。本文由PPTase的分类展开,进而阐述各类别发现的药物,综述该研究领域的最新进展,为新型抗真菌药物的研发提供参考。

PPtase高表达海洋放线菌Streptomyces sp.SCSIO 40060的次级代谢产物研究

目的对1株南海沉积物来源的PPtase高表达放线菌Streptomyces sp.SCSIO 40060进行次级代谢产物研究。方法利用硅胶柱色谱、薄层色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱和高效液相色谱(HPLC)等手段对PPtase高表达菌株发酵产物进行分离纯化;运用核磁共振(NMR)、质谱(MS)等波谱方法,并结合相关文献数据比对,鉴定化合物的结构。结果从PPtase高表达菌株发酵产物中分离纯化得到7个化合物,包括5个二酮哌嗪类化合物、1个萘醌衍生物和1个萘甲酸衍生物,分别为methoxyneihumicin(1)、XR334(2)、(S,Z)-3-benzylidene-6-isopropylpiperazine-2,5-dione(3)、(S,Z)-3-benzylidene-6-methylpiperazine-2,5-dione(4)、(3Z,6Z)-3-(4-methoxybenzylidene)-6-(2-methylpropylidene)-piperazine-2,5-dione(5)、2-methoxy-1,4-naphthoquinone(6)、1-hydroxy-4-methoxy-2-naphthoic acid(7)。

海绵共生萎缩芽孢杆菌C89 PPTase bap基因的异源表达

【背景】磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)催化非核糖体肽合成酶(NRPS)中肽酰载体蛋白(PCP)从无活性的脱辅基形态转化为有活性的全辅基形态,从而启动非核糖体肽类化合物的生物合成。【目的】鉴定贪婪倔海绵共生萎缩芽孢杆菌C89中Sfp型PPTase Bap,验证Bap激活NRPS中PCP的能力。【方法】通过BLAST和氨基酸多序列比对鉴定萎缩芽孢杆菌C89中Sfp型PPTase Bap。将bap基因在sfp基因突变株枯草芽孢杆菌168中异源表达,通过重组菌枯草芽孢杆菌168-bap的代谢物检测非核糖体肽类化合物Surfactin。【结果】Bap为Sfp型PPTase,检测到重组菌枯草芽孢杆菌168-bap中Surfactin的产生。【结论】本研究为海洋萎缩芽孢杆菌中NRPS基因簇的异源表达奠定了基础。

调节博来霉素生物合成基因的研究进展

博来霉素为氨基糖肽类抗肿瘤抗生素,具有良好的抗肿瘤活性。本文介绍了博来霉素生物合成基因的研究进展,包括博来霉素生物合成基因各基因的结构和功能、BlmⅨ/BlmⅧ/BlmⅦ组成的杂合系统和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶对杂合系统中的载体蛋白的翻译后修饰作用。

酿酒酵母表达和纯化功能性的铁载体合成蛋白PchE

【目的】利用酿酒酵母表达系统,通过乙醇脱氢酶启动子异源表达细菌源的铁载体合成蛋白PchE,并与来源于枯草芽孢杆菌的泛酰化酶Sfp同宿主共表达,探索真核表达体系表达具有生化活性的细菌源蛋白。【方法】从大肠杆菌BAP 1染色体上扩增sfp基因,将pchE基因及串联的pchE与sfp基因分别构建到酵母-大肠杆菌穿梭质粒pXW55中,各自转化酿酒酵母BJ5464-npgA表达,经过亲和层析和离子交换层析纯化蛋白,利用HPLC检测细菌源与酵母源表达的PchE在体外重构生化反应中的催化活性。【结果】利用酿酒酵母表达系统可以获得高纯度的原核蛋白PchE。真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰PchE,合成中间产物HPT-Cys。【结论】在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BJ5464-npgA表达系统中,首次证明真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰细菌源的非核糖体肽合酶。比较酵母和细菌宿主的目标蛋白表达,证明酵母表达的巨大蛋白PchE的纯度更高,非特异性条带减少,推测酵母宿主可能更适合表达纯化功能性的巨型蛋白质。