儿童头皮及光滑皮肤组织对体外培养犬小孢子菌PQ-LRP表达水平的影响

目的探讨儿童头皮与光滑皮肤组织对体外培养犬小孢子菌膜绑定蛋白编码基因(PQ-LRP)表达水平的影响。方法以18SrRNA基因为内参,应用RT-PCR方法检测SDA培养基中自患儿皮损处分离的头癣株、体癣株第1代及第5代PQ-LRP的mRNA水平;检测体外经儿童头皮及光滑皮肤组织诱导培养后头癣株及体癣株PQ-LRP的mRNA水平。结果 IODPQ-LRP/IOD18S rRNA(SDA第1代头癣株)为1.0352±0.11279,IODPQ-LRP/IOD18S rRNA(SDA第5代头癣株)为1.1157±0.11530,二者差异无统计学意义(P>0.05);IODPQ-LRP/IOD18S rRNA(头皮组织诱导后头癣株)为2.1375±0.11093,与未经诱导者相比差异有统计学意义(P<0.01);IODPQ-LRP/IOD18S rRNA(SDA第1代体癣株)为0.5921±0.12025,IODPQ-LRP/IOD18S rRNA(SDA第5代体癣株)为0.6712±0.12177,二者差异无统计学意义(P>0.05);IODPQ-LRP/IOD18S rRNA(光滑皮肤诱导后体癣株)为1.4734±0.13125,与未经诱导者相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论 PQ-LRP在犬小孢子菌中有活性表达,且在头癣株中表达活性明显高于体癣株。SDA培养基中犬小孢子菌PQ-LRP呈稳定表达状态,而儿童头皮组织与光滑皮肤组织对PQ-LRP表达水平存在诱导作用,以头皮组织尤为显著。

PQ-LRP基因沉默对犬小孢子菌生长及毒力的影响

目的探讨PQ-LRP基因对犬小孢子菌生长及毒力的影响。方法野生株和干扰株分别于沙氏培养基(SDA)培养观察菌落形态;米饭培养基行扫描电镜(SEM)透射电镜(TEM)观察超微结构;构建豚鼠感染模型行直接镜检和组织病理检查观察致病情况;液体沙氏培养基加入L-半胱氨酸,RT-PCR检测PQ-LRP基因沉默前后mRNA表达的变化。结果菌落形态:干扰株较野生株生长受限;豚鼠模型:干扰株较野生株不易感染宿主;致病豚鼠毛发皮屑真菌镜检:野生株为发内外孢子,孢子多,菌丝粗细均匀,干扰株为发外孢子,孢子少,菌丝粗细不一、弯曲不自然;豚鼠模型:野生株真皮及皮下组织见感染性肉芽肿改变,干扰株感染性肉芽肿改变不明显;半胱氨酸对犬小孢子菌PQ-LRP基因影响:野生株随半胱氨酸的浓度增加PQ-LRP基因表达水平呈上升趋势,干扰株PQ-LRP基因表达水平无规律性。结论PQ-LRP基因抑制后犬小孢子菌形态有变化、毒力减弱,推测PQ-LRP基因可能是犬小孢子菌致头癣的可能毒力基因之一。

犬小孢菌PQ-LRP蛋白的定位研究

目的用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记犬小孢子菌PQ-LRP蛋白,明确PQ-LRP蛋白在犬小孢子菌中的定位。方法提取犬小孢子菌总RNA,反转录为cDNA作为模板,PCR扩增PQLRP基因,将PQ-LRP基因与EGFP基因构成融合基因,连接到pCAMBIA 1300质粒载体.采用根癌农杆菌转化法对犬小孢子菌进行转化,使融合基因LRP-EGFP在真菌通用启动子(Ptrpc)和终止子(Ttrpc)调控下在犬小孢子菌中整合型表达,激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的细胞定位。结果成功构建表达载体pCAMBIA-LRP-EGFP,融合基因LRP-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达。激光共聚焦显微镜下LRP-EGFP的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞膜上。结论LRP-EGFP融合基因在犬小孢子菌中成功表达,且PQ-LRP蛋白定位于犬小孢子菌细胞膜上。

RNA干扰技术对犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究

目的 构建犬小孢子菌PQ-LRP基因RNA干扰载体,探讨RNA干扰载体对犬小孢子菌PQ-LRP基因表达的影响.方法 用根癌农杆菌介导的T-DNA插入突变技术,加入多克隆位点,引入潮霉素抗性基因,先后构建PUC-PLULT、PCB309-PLULT载体.应用实时PCR方法检测PCB309-PLULT载体对犬小孢子菌PQ-LRP基因表达的干扰作用.结果 构建了中间载体PUC-PLUT、PUC-PLULT,并通过PCR、基因测序进行鉴定.成功构建了长为8 825 bp的干扰载体PCB309-PLULT,并通过酶切测定为该目的载体;筛选出犬小孢子菌转化子的潮霉素最佳浓度为300 mg/L;用实时定量PCR方法对犬小孢子菌PQ-LRP基因干扰前后表达量进行鉴定：以干扰前PQ-LRP相对表达量1.0为标准,干扰后PQ-LRP相对表达量为0.39,干扰后下调61％.结论 干扰载体PCB309-PLULT可以明显抑制犬小孢子菌PQ-LRP基因的表达.