重组pQE30 tPAr质粒在JM109菌株中的稳定性研究

将构建好的含有人变异tPA基因的重组pQE30tPAr质粒的JM10 9菌株原始种子库菌种 ,在含Amp的平板培养基划线法连续传代至 10 0代 ,其在固体培养基中生长速度、菌落形态和菌体形态、Amp抗性等方面与原始种子库无明显差异 ;每隔 10代提取质粒DNA用HindⅢ和KpnⅠ限制性内切酶切割检查 ,酶切图谱没有改变 ;DNA测序未见tPAr基因变异 .用原代和第 10 0代培养诱导表达tPAr,表达水平和tPAr活性均无明显差异 .菌体的SDS pAGE图谱也完全相同 .以上结果表明所建立的JM 10

pQE30-bgln原核表达质粒的构建和鉴定

构建重组原核表达质粒pQE30-bgln使之可以在大肠杆菌中表达以获得β-葡糖苷酶,用于提高从植物中提取白藜芦醇的得率.以克隆质粒pUCP67为模板,用降落PCR的方法扩增β-葡糖苷酶基因片段(bgln).利用原核表达载体pQE30构建pQE30-bgln重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检测质粒重组后序列情况.PCR结果显示扩增片段2.2 kb,与预期相同.重组质粒酶切后显示其大小约5.6kb,大小及酶切图谱与预期相同.经测序发现插入片段读码框正确.可用于原核表达的pQE30-bgln质粒构建成功.

重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定

目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定。方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序。利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-hALRIP,并通过酶切电泳鉴定重组质粒。结果:构建了重组克隆载体pMD18-hALRIP和重组表达载体pQE30-hALRIP,测序及酶切鉴定与预计相同。结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-hALRIP,为进一步研究该多肽奠定基础。

应用pQE30系统表达和纯化乙型肝炎病毒核心抗原

目的建立高效、快速、简便的表达和纯化ＨＢｃＡｇ系统，为进一步研究ＨＢｃＡｇ在乙型肝炎发病机理中 的作用及 ＨＢＶ Ｃ基因变异产生 ＨＢｃＡｇ特征。方法应用 ｐＱＥ３０系统在原核细胞表达和纯化 ＨＢｃＡｇ。结果目的蛋 白表达量占细菌总蛋白的２６．２％；５００ｍｌ诱导表达的菌液可得平均５ｍｇ的ＨＢｃＡｇ；纯化的ＨＢｃＡｇ纯度可达到９１.０％； 免疫印迹分析，表达的ＨＢｃＡｇ具有多克隆抗－ＨＢｃ结合活性。结论建立了一套高效、快速表达和纯化ＨＢｃ Ａｇ系统。

福氏志贺菌ipaB-pQE30重组质粒的构建

目的:福氏志贺菌的ipaB基因与大肠杆菌质粒pQE30融合,构建ipaB-pQE30重组质粒。方法:以福氏志贺菌2a2457T(Nalr)为模板,用PCR扩增ipaB目的基因片段,提取大肠杆菌pQE30质粒,经KpnI和SalI双酶切、DNA纯化后,用T4DNA连接酶将ipaB与pQE30进行连接。结果:ipaB-pQE30重组质粒接种在TOP-10中存活。结论:成功构建了ipaB-pQE30重组质粒。

日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获Sj26GST和Sj32抗原编码基因;采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST-Sj32融合基因;将融合基因克隆至原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32并转化大肠埃希菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出约1 991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入pQE30中,SDS-PAGE显示表达产物为分子质量单位约为61 ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的18%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。

Myostatin基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化与鉴定

应用基因工程技术,将合成Myostatin C-末端区(330bp)的基因序列,克隆至原核表达载体pQE30,以构建人的Myostatin基因原核表达载体.构建的重组质粒pQE-Ms转染大肠杆菌宿主菌DH5α后,IPTG诱导表达重组蛋白.应用SDS-PAGE电泳和Western Blot分析和鉴定了重组蛋白的特异性,并用镍离子亲和色谱柱层析进行目的蛋白的纯化与鉴定.结果表明:重组质粒pQE-Ms酶切和测序结果与预期相符,SDS-PAGE电泳和Western Blot证实表达蛋白为目的蛋白,蛋白表达形式为包涵体,经镍离子螯合亲和层析柱纯化及鉴定,确定实验获得了高纯度的目的蛋白,为人体血清中Myostatin蛋白表达的检测及特异性抗体制备等研究提供了实验依据.

重组α-环糊精葡萄糖基转移酶表达条件的优化及其产物专一性的分析

将来源于Bacillus sp 602-1的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT)基因(cgt)插入到表达载体PQE30中,构建重组质粒PQE30/cgt,成功转化宿主菌E.coli M15后,得到重组菌株E.coli M15(PQE30/cgt)。在IPTG的诱导下得到酶表达的最适条件:TB培养基,0.01 mmol/L IPTG,诱导温度16℃,胞内酶比活力最高可达5 209 U/mL;加入IPTG 24 h后,添加甘氨酸和甘露醇会促使酶向胞外分泌。酶蛋白自诱导表达的适宜条件为在TB培养基中添加乳糖3.0 g/L,葡萄糖1.2 g/L,16℃培养96 h,酶比活力达到8 635 U/mL,明显高于IPTG诱导的效果。通过SDS-PAGE验证了上述结论。酶催化转化实验表明:重组酶转化质量分数为1%可溶淀粉24 h后,α-环糊精(α-CD)转化率可达38.2%,α和β的峰面积比约为3.4∶1,α-CD具有较高的专一性,因此该重组α-CGT酶具有较好的工业化应用前景。

志贺毒素B(ShT-B)亚单位在两种表达载体中表达形式的分析

用KpnⅠ和HindⅢ双酶切pGEM -TB3 克隆质粒 ,得到为大小约为 2 2 5bp的ShT -B基因片段 ,分别将其插入到经双酶切的 pQE4 0和 pQE30表达载体中 ,构建了两个ShT -B的重组表达质粒pQE4 0 -B3 和 pQE30 -B2 ,分别转化到E .coliM15。经IPTG诱导后 ,重组质粒目的蛋白均得到表达。其中 ,pQE4 0 -B3 和pQE30 -B2 ,分别化到E .coliM 15 ,经IPTG诱导后 ,重组质粒目的蛋白均得到表达。其中 ,pQE4 0 -B3 表达蛋白约占菌体总蛋白的 37% ,主要为包涵体形式。pQE30 -B2 表达蛋白约占菌体总蛋白的 16 % ,主要为可溶性形式 ,约 9 2 %。为重组抗原的制备提供了必要的物质基础。

IL3-PE38KDEL融合基因的构建及原核表达

目的:构建原核表达载体PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL,并诱导和鉴定其蛋白表达。方法:用PCR方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体PQE30-Linker中得到融合基因PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL。重组载体经酶切,菌落PCR鉴定,DNA序列分析插入片段完全正确,转化感受态大肠杆菌SG13009,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析分子量大小,Western blot鉴定。结果:经限制性内切酶酶切鉴定,菌落PCR及DNA序列分析表明重组表达载体PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL构建成功,IPTG诱导后得到了与预计分子量相符的目的蛋白。经Western blot鉴定在分子量57kD处有明显特异性条带,说明目的蛋白正确表达。结论:成功构建融合蛋白IL3-PE38KDEL,为后续的蛋白质纯化及功能研究奠定基础。

重组人TGF-β1在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫原性测定

目的:构建人转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)的原核表达载体,表达、纯化并鉴定该蛋白。方法:应用基因重组技术,构建人TGF-β1原核表达载体pQE30-TGF-β1,用SDS-PAGE电泳分析所表达蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白后用Western blot检测,同时用该蛋白免疫BALB/c小鼠,测定免疫血清效价。结果:成功构建了人TGF-β1的原核表达载体pQE30-TGF-β1,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在约Mr14kDa处出现了一条新生的蛋白条带。经Ni-NTA亲和层析纯化后,Western blot检测显示,重组蛋白6×his-TGF-β1能很好地与抗TGF-β1单克隆抗体特异性结合,并能够诱导BALB/c小鼠产生抗人TGF-β1的中和抗体,免疫血清的效价为1:10000。结论:转化生长因子β1是一种多功能细胞因子,在肿瘤的免疫逃避中发挥重要作用。

乙型肝炎病毒e抗原前体蛋白在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化及其特性的初步研究(英文)

目的 研究仅存在宿主细胞内的HBeAg前体蛋白 (2 5kD)在乙型肝炎发病机制中的作用和QIAGEN表达和纯化系统在HBV研究中的价值。方法 HBV前C/C基因被克隆到表达载体pQE30中 ,HBeAg前体蛋白 (2 5kD)在大肠杆菌中表达后纯化 ,经ELISA和westernblot检测其是否具有成熟HBeAg(17kD)的抗原性。结果 表达载体中的克隆片段经测序后证实为ayw亚型。在T5启动子的调节下可表达 2 5kD的可溶性溶合蛋白 ,合成的HBeAg前体蛋白在与抗HBe反应方面具有与成熟HBeAg(17kD)相同的抗原性。表达的HBeAg前体蛋白经纯化后纯度可达 89 6 %。每升诱导后的菌液可得到HBeAg前体蛋白 2 4mg。结论 HBeAg前体蛋白 (2 5kD)具有与成熟HBeAg相同的反应原性 ,在乙型肝炎的发病机制中可能起着重要作用。

我国HIV-1流行株gp41抗原表位筛选与串联表达

目的 探讨HIV 1gp4 1抗原表位串联表达蛋白用于HIV抗体检测的可行性。方法用HIV 1gp4 1蛋白亲和层析柱制备HIV 1感染者血清中的多克隆抗体 ,用噬菌体展示随机十二肽库进行生物淘洗 ,反向吸附非特异性噬菌体。经ELISA鉴定阳性克隆 ,DNA测序 ,确定优势表位。将优势表位与文献报道的另一个优势表位串联 ,克隆入pQE30载体进行蛋白表达。结果 成功筛选到位于HIV 1gp4 1蛋白上的优势抗原表位 (YGPKDAETTAIW ) ,串联表位 (YGPKDAETTAIW GGGS SC SAKFTCTTQI)在pQE30载体中实现可溶性表达。重组蛋白具有良好的抗原性 ,能与不同的HIV 1抗体阳性血清呈特异反应。结论 HIV 1gp4 1抗原表位串联表达设计是可行的 ,串联表位重组蛋白可用于HIV 1抗体检测 ,但检测灵敏性低于常规方法。