PQQ依赖性呕吐毒素脱氢酶的鉴定与性能表征

谷物及其制品中呕吐毒素(DON)的污染给人类健康造成了潜在威胁。利用生物酶将真菌毒素转化为低毒产物的生物脱毒技术是一种环保且高效的脱毒方法。本研究基于同源比对方法,从呕吐毒素脱毒菌株德沃斯氏菌Devosia sp.FJ2-5-3的基因组中挖掘鉴定了1个呕吐毒素(DON)脱毒酶编码基因adh2,对该基因进行克隆、表达并进一步对其编码酶的酶学性质进行了表征。结果表明:adh2基因长度1770 bp,其编码的ADH2酶原由589个氨基酸组成,N端前1~24个氨基酸为信号肽,属于Ⅰ型吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)依赖性醇脱氢酶。该酶最适反应pH=9,最适反应温度为35℃,在65℃孵育4 h后仍保留50%以上的酶活,显示了较好的热稳定性;另外,Ca^(2+)是其必须辅因子,而1%的乙醇和异丙醇均对其活性有明显抑制作用。ADH2对DON的Km和Kcat值分别为(708.00±47.01)μg/mL和(3.37±0.11)S^(-1),该研究结果可为PQQ依赖性呕吐毒素脱氢酶后续工业化应用提供参考。

pqq基因簇在Escherichia coli DH5α中表达及对其溶磷促生的影响

为丰富植物促生菌的构建模式,本文以Escherichia coli DH5α为供试菌株,通过遗传转化,将水生拉恩氏菌(Rahnella aqautilis)HX2的pqq基因簇导入E.coli DH5α,获得DH5α(pqq)菌株,采用平板溶磷、钼锑抗比色法、HPLC法、温室盆栽等试验分析研究DH5α(pqq)菌株溶磷产酸促生作用机理。DH5α(pqq)菌株与E.coli DH5α相比,溶磷圈直径、有效磷浓度增加,溶解矿质磷的能力显著增强;有机酸代谢显著增加,以产葡萄糖酸为主。DH5α(pqq)处理与对照相比对玉米株高、茎鲜重、植株鲜重、茎干重、植株干重、全磷、土壤有效磷分别提高了5.2%、30.0%、32.5%、18.5%、7.7%、30.8%和24.0%,并呈显著性差异(P<0.05)。表明来自HX2菌株的pqq基因簇通过异源表达具有活性,能够实现对溶磷促生的遗传改造。

磁性纳米分子印迹聚合物的制备及其对生物体内PQQ-DA痕量产物的研究

以磁性Fe_3O_4为内核,对磁性纳米粒子表面进行包裹和修饰,制备了对吡咯并喹啉醌-多巴胺(PQQ-DA)具有高识别性、高选择性的磁性纳米分子印迹材料,并结合超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)测定了生物体内PQQ-DA的含量。结果显示,PQQ-DA在0.02～0.1 mg/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(r^2)为0.996 6,检出限为0.2×10^(-11) mg/mL,加标回收率为88.7%～95.5%,相对标准偏差为2.6%～3.2%。该方法灵敏度高、重复性好,可用于生物体内PQQ-DA痕量产物的检测。

HPLC法测定吡咯喹啉醌(PQQ)中咪唑并吡咯喹啉(IPQ)的含量

目的:建立吡咯喹啉醌(PQQ)中IPQ的含量测定方法。方法:采用TCI Kaseisorb LC ODS 2000色谱柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相为乙腈-缓冲溶液(配制10mmol的磷酸氢二钾和15mmol的四丁基溴化铵水溶液,用磷酸调节pH至7.4)[28∶72];紫外检测器,检测波长为259nm;流速为1.0mL/min;进样量为20μL。结果:IPQ在0.05μg/mL^0.2μg/mL范围内线性关系良好,相关系数大于0.999。IPQ的回收率在104%~113%之间,RSD最大为3%。结论:该方法具有良好的专属性、检测灵敏度、精密度、线性和准确度,适用于PQQ中IPQ的质量控制。

依赖新辅基PQQ甲醇脱氢酶的研究

生长在以甲醇作唯一碳源的甲基营养菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｂａｃｔｅｒｉａ）Ｎｏ．２细胞，经超声波破碎，缓冲液抽提，ＤＥＡＥ－和ＣＭ－纤维素柱层析等纯化步骤，可得到纯化的甲醇脱氢酶（ＭＤＨ），其比活力为５．７ｕ／ｍｇ．该酶进行不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用相应的试剂分别染色，其蛋白质，酶活性和醌蛋白谱带均呈现一条迁移距离相同的主带．该酶由两个β亚基（６０ｋｂ）和两个α亚基（１０ｋｂ）构成，每个α亚基束缚一个新辅基ＰＱＱ（吡咯喹啉醌）．光谱分析显示，２９０ｎｍ有一肩峰，３４５ｎｍ有一特征峰，４００ｎｍ有一平台．这些数据表明。

NMDA受体显像剂^(99m)Tc-PQQ酯的药物动力学研究

用药物动力学定域模型及向量分析方法研究99mTc-PQQ酯(99mTc-4,5-dioxo-4,5-dihydro-1H-pyrrolo(2,3-f)quinoline-2,7,9-tricarboxylic acid 2-ethyl ester 7,9-dimethyl ester)在小鼠血和脑中的药物动力学,以用于研究NMDA受体(N-methyl-D-aspartate receptor)显像。随机选取8组18 22 g的小鼠(每组5只,一组用于血药动力学,其他用于脑药动力学),从尾静脉注入99mTc-PQQ酯(0.2mL,10 MBq),血药动力学组于注射后5、15、30、60、120、180、360 min从尾静脉抽取10μL血样;其他组于注射后同样的时间间隔处死,取脑组织(海马、额叶、顶叶、小脑、枕叶、纹状体、脑桥和延髓、颞叶和丘脑)并称重,用γ-counter测放射性计数。用药物动力学定域模型计算动力学方程和参数、构作解空间、进行向量分析。动物实验数据表明,99mTc-PQQ酯能在海马、额叶和顶叶中浓聚。根据药物动力学定域模型计算,动力学方程分别为:海马C=0.24e 0.042t+0.28e 0.0045t,额叶C=0.22e 0.042 t+0.27e 0.0045t,顶叶C=0.24e 0.042t+0.21e 0.0045t,小脑C=0.23e 0.042t+0.11e 0.0045t,枕叶C=0.17e 0.042t+0.14e 0.0045t,纹状体C=0.11e 0.042t+0.17e 0.0045t,脑桥和延髓C=0.10e 0.042t+0.18e 0.0045t,颞叶C=0.14e 0.042t+0.14e 0.0045t,丘脑C=0.14e 0.042t+0.09e 0.0045t。血药动力学参数计算为:k12=0.0173 min 1,k21=0.0096min 1,ke=0.0196 min 1,CL=0.13 ID%g 1.min 1,AUC=753.68 ID%g 1.min,t1/2α=16.50 min,t1/2β=155.35 min等。对应于各脑组织向量的模与99mTc-PQQ酯在各脑组织中的最高浓度成线性关系,回归方程为y=1.3287x 0.0229,R2=0.9487。解空间和向量分析表明,99mTc-PQQ酯在海马、额叶和顶叶中的动力学行为相似,但与其在其他脑组织中的动力学行为有一定差异。药物动力学研究结果表明,99mTc-PQQ酯能在某些脑组织(如海马、额叶和顶叶)中浓聚。该药物在脑组织中有利的摄取和适宜的滞留证实了其能在体内与NMDA受体结合。

Crystal structure of PqqB from <i>Pseudomonas putida</i>at 2.2 Åresolution

Pyrroloquinoline quinone (PQQ) is an important redox-active cofactor for many bacterial dehy-drogenases. It's biosynthetic pathway involves six or seven genes, one of which is pqqB. Former studies indicated that the protein encoded by pqqB, namely PqqB, functions as a PQQ transporter. Here we report the crystal structure of PqqB from Pseudomonas putida at 2.2 ? resolution together with functional studies to verify this theory.

石斛内生菌SH-1 PQQ基因的克隆与生物信息学分析

从石斛内生菌变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1中PCR扩增得到吡咯喹啉醌(PQQ)基因,其大小为5 444 bp,包含了pqqABCDEF 6个基因,并对PQQ基因进行了生物信息学分析,为下一步构建高效基因工程菌,研究其生物合成途径奠定了基础。

嗜甲基细菌Serratia Marcescens NH8的筛选及其pqq基因的克隆

以甲醇为唯一碳源,从土壤中筛选获得一株长势优良的嗜甲基营养菌NH8,对其16SrRNA基因序列分析,初步鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),命名为Serratia marcescens NH8.通过下载数据库中pqq基因簇序列进行多重比对,设计PCR扩增引物,从Serratia marcescens NH8中成功克隆出吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone,PQQ)合成相关的pqq基因簇片段.该基因簇序列全长5 535bp,由6个开放阅读框pqqA,pqqB,pqqC,pqqD,pqqE和pqqF组成,并且与Serratia marcescens WW4的pqq基因簇序列同源性为99%.同时,对pqq基因簇中各基因的结构与功能进行了分析,核酸序列分析结果表明pqqB,pqqC,pqqD,pqqE和pqqF基因构成细菌操纵子发挥作用.

依赖PQQ甲醇脱氢酶对底物催化专一性差的原因分析

采用甲基营养杆菌NO .2为实验菌株 ,经超声波破细胞 ,酸处理 ,DEAE 纤维素和CM 纤维素柱层析等改进的纯化程序 ,可得到比活力为 12 .5u/mg的甲醇脱氢酶 (MDH)样品。该酶在测活系统中除能氧化甲醇等醇类化合物外 ,还能以较大速率氧化氯化铵、甲胺、脲等物质 ,MDH对不同底物亲和力的差异性主要取决于其辅基吡咯喹啉醌 (PQQ)与底物的结合力。

吡咯喹啉醌(PQQ)合成基因对PQQ产量的影响

将携带新辅基吡咯喹啉醌合成基因的克隆载体pRK310 经三亲本杂交,分别导入M.extorquens.AM1 及其突变体3b 和D2 中,可不同程度增加pqq 基因的拷贝数. 在基因复制水平构建了8 个工程菌,使PQQ产量提高了0.84～5.6 倍. 结果表明,结构上成簇的pqq 基因在功能上是密切相关、协调作用的,单个或部分pqq基因对PQQ合成的贡献是有限的,pqq 基因之间的比例和相互作用对PQQ 的合成量是有重要意义的.pqq 基因簇中起转录衰减作用的反向重复序列可能是pqq 基因正常转录所必需的.

PQQ和IAA促生因子对Rahnella aquatilis HX2菌株促生机理研究

【目的】Rahnella aquatilis HX2菌株能合成吡咯喹啉醌(PQQ)和吲哚乙酸(IAA),探明PQQ与IAA在HX2菌株促生作用中的作用与机理。【方法】通过试管苗试验、温室砂培试验,分别以纯品PQQ、纯品IAA、HX2菌株及PQQ合成缺失突变体及互补菌株等处理接种玉米,对各处理的玉米生长量、营养以及根形态方面的影响进行检测和分析。【结果】与空白对照相比,PQQ、IAA纯品处理均能在促进玉米生长方面均有好的效果,HX2处理在玉米生物量(株高、鲜重和干重)、玉米营养(全N、全P、全K)摄入有显著提高,处理效果更好;PQQ合成缺失突变体MH15处理,虽对玉米鲜重、干重、全N、全P与对照相比有促进作用,但与HX2和互补菌株CMH15(pqq)处理玉米的促生效果相比较低。纯品PQQ、IAA处理主要提高了其细根长、中根长、总根长的长度和根表面积增加,但其根平均直径降低;而HX2菌株处理增加了其细根长、中根长、粗根长的长度,使玉米根系不仅伸长,且根系变粗。【结论】PQQ可作为直接促生因子和IAA,共同参与了HX2菌株对增加玉米生物量,提高玉米营养的摄入,促进其根形态等方面起到关键调控作用,明确了HX2菌株-PQQ-玉米、HX2菌株-IAA-玉米之间的相互作用。

不同碳源条件下PQQ对植物促生菌Rahnella aquatilis HX2溶解无机磷影响的研究

【目的】水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)HX2能合成葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,GDH)和吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ),PQQ为GDH辅酶,与其共同参与葡萄糖溶磷代谢。揭示不同碳源条件下PQQ影响HX2菌株溶解无机磷作用的机理。【方法】以野生菌株HX2、突变体MH15及其互补菌株CMH15(pqq)为供试材料,在不同碳源条件下采用平板溶磷、钼锑抗比色法等方法对其进行溶解无机磷定性、定量以及p H相关分析。【结果】除D-山犁醇、D-果糖外,PQQ参与HX2菌株对木糖、葡萄糖、D-甘露糖、D-甘露醇、蔗糖、乳糖6种碳源的溶磷代谢,但其溶磷代谢因HX2菌株利用不同碳源的能力而不同,以乳糖利用最低,木糖利用最高。【结论】PQQ作为GDH的辅酶,两者共同参与HX2菌株的木糖、葡萄糖、D-甘露糖、D-甘露醇、蔗糖和乳糖溶解无机磷代谢,并起到重要调控作用。

低温胁迫下PQQ对黄瓜幼苗子叶防御系统的影响

报道了低温胁迫下吡咯喹啉醌（ＰｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅＱｕｉｎｏｎｅ，ＰＱＱ）对黄瓜幼苗子叶超氧化物岐化酶（ＳＯＤ），抗坏血酸过氧化物酶（ＡｓＡＰＯＤ）和谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量的影响，并与常规的外源活性氧清除剂８－羟基喹啉（８－ＨＱ），抗坏血酸（ＡｓＡ）进行了比较．结果表明，ＰＱＱ能提高ＳＯＤ，ＡｓＡＰＯＤ活性，增加ＧＳＨ含量．缓解电解质泄漏，减缓质脂过氧化作用．ＰＱＱ可作为活性氧清除剂，调节生物体内自由基代谢平衡，提高植物的抗逆性．

PQQ对巨噬细胞炎症抑制及机制的初步研究

探讨吡咯喹啉醌(PQQ)对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子基因表达的影响及机制.培养RAW264.7细胞、BMDM细胞和THP-1细胞,分为对照组和实验处理组,用MTT方法检测PQQ对细胞增殖的影响,并分别用RT-qPCR和Western Blot检测各炎症因子的基因及蛋白表达情况.PQQ预处理能使LPS诱导的炎症因子表达量下降,并使P-P65蛋白表达下降,Nrf2蛋白表达增加.PQQ预处理降低细胞内炎症反应,这一过程可能通过增加Nrf2表达和抑制NF-κB表达而发挥作用.

Effects of PQQ on Protective System in Cucumber Cotyledons under Low Temperature Stress

The authors have studied the effects of Pyrroioguinloine quinone (PQQ) on superoxide dismutase (SOD), Ascorbid acid(AsA) peroxidase (AsAPOD), glutathion (GSH) and electrolytic leakage of cotyledon in cucumber seedling under low temperature stress, meanwhile, 8-hydroquinone (8-HQ) and AsA (activeoxiygen scavengers) have been made use of in comparison with PQQ. The results indicate that the activities of SOD, AsAPOD and content of GSH can be increased by PQQ. The relative conductivity of cotyledon in cucumber seedling is decreased for PQQ possesses the ability of cleaning up free redical of oxygen. We came to the conclusion that PQQ can act as a kind of active oxygen scavenger and adjust the metabolism on free radical of oxygen to balance in plants and enhance resistance finally in plants.

PQQ对低温胁迫下早稻幼苗生理特性的影响

以早稻品种湘早籼42号为材料,研究不同浓度的PQQ溶液对低温胁迫下早稻幼苗生理特性的影响。结果表明:低温胁迫前叶面喷施0.5和1μmol/L PQQ溶液,活苗率较对照大幅提高,分别达到40.23%和43.14%,与对照差异显著;而PQQ溶液浓度≥25μmol/L时活苗率反而降低;低温胁迫前喷施0.5μmol/L的PQQ,对株高、鲜重、干重和含水量的影响与对照差异不显著;而低温胁迫5 d时,PQQ处理过的幼苗电导率降低了7.19个百分点、MDA含量减少了5.23 nmol/g、脯氨酸和可溶性糖含量分别增加了8.02μg/g和23.4 mg/g、SOD和POD酶活性分别提升了9.19%和11.45%,与对照的差异均达显著水平。这表明PQQ可通过提高抗氧化酶活性和调节非酶促防御系统同时减轻低温胁迫对水稻幼苗造成的伤害,提高水稻幼苗耐冷能力。

不同碳氮源配比对脱氮生丝微菌FJNU-R8生长和PQQ合成的影响

为了提高脱氮生丝微菌FJNU-R8生产PQQ的能力,以FJNU-R8为出发菌株,探究了不同碳氮源配比对其生长和PQQ合成的影响。通过探讨4种单一碳源和4种单一氮源对菌株生长和PQQ合成影响的基础上,进一步研究不同配比和不同浓度的复合碳源(甲醇∶甘油)/复合氮源(蛋白胨∶硫酸铵)对菌株生长和PQQ产量的影响。结果表明:以甲醇为单一碳源,OD_(650)仅为4.4,但PQQ产量43 mg·L^(-1),以甘油为单一碳源,OD_(650)可达9.8,但无PQQ产量;以硫酸铵为单一氮源,OD_(650)仅为4.2,但PQQ产量30 mg·L^(-1),以蛋白胨为单一氮源,OD_(650)可达7.7,但无PQQ产量。不同配比的复合碳源可以提高OD_(650),甘油比重越大,最终OD_(650)越高,但PQQ产量很低;不同配比的复合氮源可以提高生长速度,蛋白胨∶硫酸铵为40∶60时PQQ产量65 mg·L^(-1)。复合碳源(甲醇∶甘油为20∶80)的浓度越高,最终OD_(650)越高,但PQQ产量越低;复合氮源(蛋白胨∶硫酸铵为40∶60)浓度高于1 g·L^(-1)时,OD_(650)及PQQ产量无明显变化,最终OD_(650)约为7.5,PQQ产量约为45 mg·L^(-1)。结果显示复合碳源可提高OD_(650),复合氮源可提高PQQ产量,可为后续高产PQQ的碳氮源选择提供理论依据。