牛肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢酶cDNA的克隆及组织表达

NADP(H) dependent retinol dehydrogenase/reductase (NRDR) was an important retinoic acid synthase, which was first purified from rabbit liver in 1997. In order to study the function of the NRDR gene,the full length cDNA of bovine NRDR was cloned. According to the conserved sequences of human, mouse and rabbit NRDR cDNA, a pair of primers was designed to amplify a 294 bp DNA fragment of bovine liver NRDR, and then the full length of NRDR cDNA (AF487454) was cloned by using 3′ RACE and 5′ RACE. All the cloned NRDR proteins consist of 260 amino acid residues and showed high identity among them. The tri peptide of human, mouse and rabbit NRDR C end was SRL and that of bovine NRDR C end was SHL, but both were considered to be peroxisomal target signal 1 (PTS1). RT PCR demonstrated that NRDR gene was expressed in liver, heart, lung, kidney, stomach and intestine, and was not found in pancreas, muscle, artery and skin. The full length bovine NRDR cDNA has been successfully cloned and the sequence was analyzed. It provided a reliable foundation to investigate the biological function of this protein.

依赖新辅基PQQ甲醇脱氢酶的研究

生长在以甲醇作唯一碳源的甲基营养菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｂａｃｔｅｒｉａ）Ｎｏ．２细胞，经超声波破碎，缓冲液抽提，ＤＥＡＥ－和ＣＭ－纤维素柱层析等纯化步骤，可得到纯化的甲醇脱氢酶（ＭＤＨ），其比活力为５．７ｕ／ｍｇ．该酶进行不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用相应的试剂分别染色，其蛋白质，酶活性和醌蛋白谱带均呈现一条迁移距离相同的主带．该酶由两个β亚基（６０ｋｂ）和两个α亚基（１０ｋｂ）构成，每个α亚基束缚一个新辅基ＰＱＱ（吡咯喹啉醌）．光谱分析显示，２９０ｎｍ有一肩峰，３４５ｎｍ有一特征峰，４００ｎｍ有一平台．这些数据表明。

PQQ依赖性呕吐毒素脱氢酶的鉴定与性能表征

谷物及其制品中呕吐毒素(DON)的污染给人类健康造成了潜在威胁。利用生物酶将真菌毒素转化为低毒产物的生物脱毒技术是一种环保且高效的脱毒方法。本研究基于同源比对方法,从呕吐毒素脱毒菌株德沃斯氏菌Devosia sp.FJ2-5-3的基因组中挖掘鉴定了1个呕吐毒素(DON)脱毒酶编码基因adh2,对该基因进行克隆、表达并进一步对其编码酶的酶学性质进行了表征。结果表明:adh2基因长度1770 bp,其编码的ADH2酶原由589个氨基酸组成,N端前1~24个氨基酸为信号肽,属于Ⅰ型吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)依赖性醇脱氢酶。该酶最适反应pH=9,最适反应温度为35℃,在65℃孵育4 h后仍保留50%以上的酶活,显示了较好的热稳定性;另外,Ca^(2+)是其必须辅因子,而1%的乙醇和异丙醇均对其活性有明显抑制作用。ADH2对DON的Km和Kcat值分别为(708.00±47.01)μg/mL和(3.37±0.11)S^(-1),该研究结果可为PQQ依赖性呕吐毒素脱氢酶后续工业化应用提供参考。

不同诱导物对白地霉中高级醇脱氢酶的影响

化学或物理因子作为诱导物,能够直接或间接影响菌体基因转录表达。为探索高级醇底物对白地霉的诱导效果,以分离自土壤的白地霉S12为对象,采用五种高级醇(正丙醇、正丁醇、异丁醇、正己醇和异戊醇)作为诱导物,研究不同高级醇的诱导剂量、诱导时间对菌体S12降解不同高级醇活性及脱氢酶活力的影响。结果表明,当正己醇和异丁醇分别作为诱导剂时,胞内酶活力较高。正丙醇、正丁醇、异丁醇和正己醇作为诱导剂时,最适诱导时间均为6 h;而以异戊醇为诱导剂时,最佳诱导时间为12 h。以正丙醇和正己醇为诱导剂时,最适的诱导浓度为1.5 g/L;以正丁醇、异丁醇和异戊醇为诱导剂时,最适诱导浓度分别为1.0、0.5和2.5 g/L。NativePAGE电泳结果表明,以五种高级醇为诱导剂均能使菌体合成分子量为223 kDa左右的脱氢酶。其中,以正己醇为诱导剂时所得菌体同时降解多种高级醇的能力最强,其降解产物均为其相应的酸类和酯类物质。

依赖PQQ甲醇脱氢酶对底物催化专一性差的原因分析

采用甲基营养杆菌NO .2为实验菌株 ,经超声波破细胞 ,酸处理 ,DEAE 纤维素和CM 纤维素柱层析等改进的纯化程序 ,可得到比活力为 12 .5u/mg的甲醇脱氢酶 (MDH)样品。该酶在测活系统中除能氧化甲醇等醇类化合物外 ,还能以较大速率氧化氯化铵、甲胺、脲等物质 ,MDH对不同底物亲和力的差异性主要取决于其辅基吡咯喹啉醌 (PQQ)与底物的结合力。

近平滑假丝酵母NAD(H)依赖型次级醇脱氢酶的分离纯化及酶学性质

从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC 203011)中分离得到了NAD(H)依赖型的次级醇脱氢酶.粗酶经乙醇沉淀、Blue Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE Sepharose离子交换层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的亚基分子量(Mr)为37.5×103.该酶还原反应的最适pH为6.0,最适温度为45℃,是一个含Zn2+金属酶.该脱氢酶具有较高的底物的选择性,对2-酮具有较高的还原活力;同时,也能作用于醇类发生氧化反应,对次级醇的氧化活力最高.以β-羟基苯乙酮为底物,用纯化得到的酶催化反应后,还原产物为(R)-苯基乙二醇,因此该酶为(R)-专一性次级醇脱氢酶,是一种生产(R)-苯基乙二醇的有效的生物催化剂.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中3个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与NCBI编号为BAA24528的次级醇脱氢酶具有较高的同源性.

酿酒中高级醇形成关键酶丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的生物信息学分析

高级醇是酒的呈香呈味组分和健康风险因子。高级醇的控制是一个广泛关注的问题,但到目前为止与高级醇形成特异性关键酶有关的研究报道很少。该文对异戊醇、异丁醇和正丙醇3种主要高级醇生成途径中涉及的两类关键酶-丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylases,PDCs)和醇脱氢酶(alcohol dehydrogenases,ADHs)进行了生物信息学分析,并从底物、微生物来源、酶基因的表达、酶活力4个方面以关键酶的角度讨论了酿酒中高级醇的控制。结果显示,UniProt数据库中的PDCs和ADHs序列均来自真菌,以酵母菌属为主。不同微生物PDCs的理论等电点为5.51~5.80,ADHs的理论等电点为5.76~6.60。亚细胞定位预测结果显示PDCs和ADHs均为胞内酶。分子对接分析结果表明,具有减少酿酒中高级醇生成作用的中药材茯苓、黄芪、人参、甘草、白术和桑叶中的多数组分与PDCs和ADHs有较低的结合能。该研究可为酿酒中高级醇的控制提供参考。

NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的重组表达及甘露醇的转化条件

对NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的异源表达和对果糖的转化情况进行分析,为在细胞内构建甘露醇的合成途径奠定基础。构建重组菌株BL21(DE3)/p ET28a-mdh,对其进行诱导发酵后,通过His标签对目的蛋白进行纯化,并利用HPLC分析纯化后的甘露醇脱氢酶转化果糖生成甘露醇的情况。成功构建了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶重组表达菌株BL21(DE3)/p ET28amdh,并对表达后的甘露醇脱氢酶进行了纯化,测得纯化后的甘露醇脱氢酶酶活力为270 U/m L。对酶法转化果糖得到甘露醇的转化条件进行优化,确定最佳的转化条件为:当底物浓度为300 g/L,反应初始p H5.8,温度40℃,NADPH终浓度为9 mmol/L时,甘露醇转化率可以达到97.4%。实现了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶在大肠杆菌中的活性表达,为进一步研究大肠杆菌合成甘露醇的代谢调控提供了依据。

葡萄糖6-磷酸脱氢酶调控细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白依赖性激酶2促进细胞增殖及其在肾透明细胞癌中的预后价值

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是一种转移率高、预后差的细胞代谢性疾病,对其有效诊疗及预后分子标志物的研究十分重要。葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase,G6PD)在ccRCC中高表达,并提示患者不良预后,其促进ccRCC细胞增殖的分子机制有待进一步揭示。本研究发现,降低G6PD可抑制细胞周期G_(1)/S期转化并显著抑制ccRCC细胞增殖。G6PD可在细胞水平调控G_(1)/S期转化及增殖相关因子Cyclin D1,CDK4,CDK6,Cyclin E1和CDK2基因表达。TCGA数据库分析结果表明,ccRCC中Cyclin D1,Cyclin E1和CDK2的mRNA水平显著升高,而CDK4表达无明显差异,CDK6表达却显著降低。相关性分析结果显示,G6PD与Cyclin D1呈显著负相关(P<0.0001),G6PD与CDK4,CDK6之间无显著相关性(P>0.05),G6PD与Cyclin E1(P<0.0001)以及CDK2(P<0.05)显著正相关。进一步免疫组化检测结果表明,Cyclin E1和CDK2在ccRCC肿瘤组织中表达显著升高。生存预后分析结果显示,Cyclin D1高表达提示ccRCC患者整体预后更为良好,CDK4和CDK6表达水平在ccRCC患者总生存率预测中无意义;而Cyclin E1和CDK2高表达均可提示ccRCC患者预后不良。进一步细胞水平检测发现,Cyclin E1、CDK2表达降低可显著逆转G6PD促进ccRCC细胞增殖的能力。综上,与增殖相关因子Cyclin D1,CDK4和CDK6相比,G6PD有可能通过促进Cyclin E1和CDK2表达升高而发挥促进ccRCC肿瘤细胞增殖的作用,并且这3者的异常高表达有望成为ccRCC患者不良预后的独立生存预测因素。

烟草中依赖于NAD^+的山梨醇脱氢酶基因的克隆及序列分析

以珊西烟(Nicotiana tabacum L.cv Xanthi NN)为材料,通过RT-PCR,首次克隆了烟草中山梨醇脱氢酶基因(NAD+-SDH),该基因全长1119bp,编码372个氨基酸残基,其氨基酸序列与番茄和葡萄的山梨醇脱氢酶同源性分别为92%和87%。

1-磷酸甘露醇脱氢酶基因转化水稻的研究

PCR和 Southern blotting检测表明 ,来自大肠杆菌的 mtl D基因已通过农杆菌介导整合进水稻基因组。mtl D基因在 T1代出现分离 ,T2 代出现纯系。在 0 .75% Na Cl胁迫下 ,7个转基因 T3 代株系都能检测到 mtl D酶活性 ,与对照相比细胞膜的相对电导率和大分子渗漏值明显降低。部分转基因株系能在 1 .0 % Na Cl浓度下正常生长 ,而对照在 0 .5% Na Cl浓度下已不能存活。通过有性杂交途径实现了 mtl D和 gut D两个基因的聚合 ,部分杂交后代株系能在 1 .2 5% Na Cl胁迫下正常生长结实。

植物肉桂醇脱氢酶及其基因研究进展

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)作为植物次生代谢特别是木质素合成的关键酶,与植物生长发育和抵御病原菌入侵关系密切,研究CAD基因表达调控及其与组织木质化的关系具有重要的植物生理学意义.该文综述了植物CAD的蛋白特征、酶学性质、基因分布和分类、基因结构和表达调控以及CAD表达与木质素合成的关系,为研究CAD在植物生长发育和抗病中的作用提供理论指导.

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD6的克隆及正义、反义与RNAi干扰载体的构建

肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步反应,将肉桂醛还原生成相应的肉桂醇。采用PCR方法从棉花中克隆了GhCAD6基因1569 bp的基因组序列,序列分析表明GhCAD6基因由5个外显子和4个内含子组成。为了研究GhCAD6基因的功能,构建由棉纤维组织特异性启动子E6驱动的GhCAD6基因正义、反义表达载体;同时克隆了GhCAD6基因的一段417 bp高度保守的NBD区序列,构建了GhCAD6基因的RNAi干扰载体,并将上述载体转入农杆菌菌株LBA4404中。为通过转基因技术深入研究GhCAD6基因在棉纤维发育和木质素代谢途径中的作用创造条件。

丹参肉桂醇脱氢酶基因(SmCAD)的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)依赖于NADPH还原肉桂醛及其衍生物,是催化木质素单体生物合成途径的最后一步关键酶。通过分析丹参转录组数据库,从丹参中获得一条肉桂醇脱氢酶基因,命名为SmCAD(Genebank注册号:HQ162287)。该序列包含一个长为1083 bp的开放阅读框,有3个内含子和4个外显子,编码360个氨基酸,含有NADP(H)结合域,Zn1和Zn2锌结合位点。利用BD walking的方法获得其启动子序列1202 bp,序列分析结果表明,SmCAD启动子区包含茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)响应元件以及MYB结合位点。利用实时荧光定量PCR分析表明,该基因在丹参根、茎、叶中均有表达,且其表达受到MeJA的诱导和GA3的抑制,推测该基因可能参与了丹参对外源信号的应答反应。研究结果可为进一步研究SmCAD基因在丹参中的具体功能提供理论依据。

麦红吸浆虫滞育期间海藻糖酶和山梨醇脱氢酶活性的变化

对不同滞育阶段麦红吸浆虫海藻糖酶和山梨醇脱氢酶的活性进行了测定。结果表明，麦红吸浆虫落土滞育前，其幼虫的海藻糖酶活性最高，入土后其活性迅速下降，到9月中旬活性开始上升，随后呈下降趋势，之后又迅速升高至滞育年周期中的最高水平；不同滞育阶段麦红吸浆虫从脱离麦穗到当年11月以前，一直未检测到山梨醇脱氢酶活性，翌年2～4月，山梨醇脱氢酶的活性急剧增加，至04—20达到整个滞育期间的最高值（0．5042OD／（mL·min））；相同滞育阶段，裸露幼虫海藻糖酶活性和山梨醇脱氢酶活性较结茧幼虫略高，并表现出相同的变化趋势；不同滞育年限麦红吸浆虫海藻糖酶活性和山梨醇脱氢酶活性无明显差异。

苹果山梨醇脱氢酶基因家族的克隆及表达分析

【目的】进一步探明苹果中山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH;EC 1.1.1.14)基因家族的分子特性。【方法】从‘嘎拉’苹果中克隆SDH基因家族全长cDNA序列和gDNA序列,检测它们在叶片和果实不同生长时期的表达模式。【结果】获得了12个苹果SDH基因家族cDNA序列,依次命名为MdSDH7—MdSDH18。除MdSDH18基因的全长gDNA序列由6个外显子和5个内含子组成,其余基因的全长gDNA序列由2个外显子和1个内含子组成。根据氨基酸序列相似性可以将这些SDH基因分为A和B两类。所有SDH基因在果实不同生长期均有表达,且中后期表达高于初期,但果实初期的SDH活性高于中后期。A类SDH基因在叶片不同生长时期的表达水平为幼叶>衰老叶>成熟叶,SDH活性也呈现出同样的趋势,但B类SDH基因在叶片不同生长时期的表达水平为衰老叶>成熟叶>幼叶。【结论】进一步证明了SDH基因在苹果中是以基因家族的形式存在的,且不同的基因家族成员在叶片和果实中有不同的表达特性。

棉花肉桂醇脱氢酶基因的克隆与分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的肉桂醇脱氢酶基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD5(GenBank登录号为FJ848868)。研究结果表明:GhCAD5全长1488bp,具有一个1068bp的开放阅读框,5′非编码区为140bp,3′非编码区为280bp,编码355个氨基酸,预测分子量约为38.403kDa,等电点为7.67。氨基酸同源性分析发现,GhCAD5与拟南芥AtCAD1和水稻OsCAD4的同源性较高。利用PCR方法克隆了GhCAD5基因的基因组序列,长度为1695bp,包含6个外显子和5个内含子。将GhCAD5的ORF连接于原核表达载体pET-28a中,经IPTG诱导,获得了相应蛋白的表达。棉花GhCAD5基因的克隆为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。

醛、醇脱氢酶基因多态性与三氯乙烯药疹样皮炎易感性的关系

目的研究醛脱氢酶、醇脱氢酶基因多态性与三氯乙烯药疹样皮炎易感性的关系.方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法,比较108例三氯乙烯药疹样皮炎病人和145例健康三氯乙烯接触工人醛脱氢酶2（ALDH2）、醇脱氢酶2（ADH2）和醇脱氢酶3（ADH3）的基因多态性分布,并计算相对危险度（OR）.结果ADH2和ADH3基因型分布在病人与接触对照工人中无显著性差异;ALDH2变异型基因（ALDH2＊1/＊2＋ALDH2＊2/＊2）频率在病人中显著低于接触对照工人（分别为27.8%和43.4%,P=0.011）,使三氯乙烯药疹样皮炎的危险性显著降低（OR=0.50,95% CI=0.29～0.85）.结论高活性ALDH2可能是导致三氯乙烯药疹样皮炎个体易感性差异的原因之一.

杜仲肉桂醇脱氢酶基因克隆及序列分析

以杜仲一叶一心期幼叶为材料 ,提取总RNA ,采用RT -PCR技术分离得到 4 98bp核苷酸片段 ,此核苷酸片段与GenBank中的苹果树肉桂醇脱氢酶 (CAD)基因序列有 6 4 .1%的同源性 ,与桉树mRNACAD有 6 3.9%的同源性。所克隆的cDNA编码 16 5个氨基酸残基 ,其序列与苹果树CAD相应片段有 6 8.5 %的同源性 ,与桉树mRNACAD相应片段有 6 6 .1%的同源性。推测克隆的核苷酸片段为杜仲CAD的基因片段。

镉铅对小麦醇脱氢酶(ADH)基因表达影响的初步研究

经过镉、铅４５ｈ污染处理，运用Ｎｏｒｔｈｅｉｎ斑点杂交分析和酶活性测定的方法探测萌发期小麦ＡＤＨ酶基因的表达情况．实验结果表明，ＡＤＨ基因表达在ＲＮＡ和酶活性两个层次均有变化，并且呈现相似的变化趋势，反映重金属的影响是来源于基因转录水平．同时，ＡＤＨ基因表达量的变化是一种植物对以重金属为主导因子的环境条件的应激性反应，其中镉的效应大于铅，元素间相互作用的效应与镉铅的复合方式相关．从实验结果推测镉、铅干扰ＡＤＨ基因表达的效应是间接的．