寒喘祖帕颗粒对甲型流感病毒H1N1/PR8株感染致小鼠肺炎的作用

目的探讨寒喘祖帕颗粒对甲型流感病毒H1N1/PR8株感染小鼠肺炎的影响。方法小鼠随机分为正常组、模型组、达菲组(27.5 mg/kg)、连花清瘟颗粒组(3.3 g/kg)和寒喘祖帕低、中、高剂量组(0.38、0.76、1.52 g/kg)。除正常组外,其余组小鼠均采用甲型流感病毒H1N1/PR8株病毒液经滴鼻感染建立肺炎模型。各组连续给予相应药物4 d,取样。测定小鼠体质量、肺指数及抑制率、流感病毒载量、14 d内小鼠死亡率、生存时间;ELISA法检测肺组织中IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平,HE染色观察肺组织病理改变并评分。结果寒喘祖帕颗粒中、高剂量组可降低感染后小鼠肺指数,其肺指数抑制率分别为24.01%、32.63%;可降低死亡率,其死亡保护率分别为44.44%、50%。寒喘祖帕低、中、高剂量组均可降低小鼠肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平,改善小鼠肺部病变,延长平均存活天数,生命延长率分别为17.84%、24.32%、19.46%。结论寒喘祖帕颗粒可改善流感病毒H1N1/PR8株感染致小鼠肺炎症状,可降低死亡率、延长平均存活天数。

葛根汤颗粒对甲型流感病毒感染小鼠TNFR1/NF-κB/JNK等炎症和免疫指标的影响

目的基于PR8感染所致病毒性肺炎小鼠模型,探寻葛根汤颗粒抗流感病毒性肺炎损伤的作用机制。方法32只雌性SPF级ICR小鼠随机分为空白组、模型组、奥司他韦组、葛根汤颗粒组,每组8只。滴鼻法建立PR8毒株感染所致病毒性肺炎小鼠模型,计算肺指数和肺指数抑制率,应用光镜观察各组肺组织病理变化,运用ELISA和Western blotting法检测各组肺组织炎性细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、细胞间黏附分子-1(ICAM1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM1)和炎性免疫蛋白人肿瘤坏死因子受体-1(TNFR1)、核转录因子-κB(NF-κB)、Jun氨基末端激酶(JNK1)表达情况。结果与模型组比较,奥司他韦组和葛根汤颗粒组可降低小鼠肺指数(P<0.001),葛根汤颗粒组对肺指数抑制效果优于奥司他韦组。病理提示,与模型组比较,葛根汤颗粒组可显著减轻支气管炎症反应渗出,减轻肺泡、肺间质和红细胞渗出。ELISA结果显示,与模型组比较,奥司他韦组和葛根汤颗粒组可显著降低IL-6、ICAM1、VCAM1的表达(P<0.001);与奥司他韦组相比,葛根汤颗粒组IL-6含量降低(P<0.01)。Western blotting结果显示,与模型组比较,奥司他韦组和葛根汤颗粒组可降低TNFR1、JNK1蛋白的表达(P<0.05或P<0.01),葛根汤颗粒可降低NF-κB蛋白的表达(P<0.05)。结论葛根汤颗粒可以降低甲型流感病毒感染小鼠肺组织中IL-6、ICAM1、VCAM1、TNFR1、NF-κB、JNK等炎性因子和炎性免疫蛋白的表达,调节炎症和免疫紊乱,为仲景经典处方临床应用提供基础理论依据。

宣肺败毒颗粒增加T细胞数量减轻流感病毒肺炎的机制研究

[目的]确定宣肺败毒颗粒在低温高湿环境下,A/PR/8/34(H1N1)流感病毒肺炎小鼠模型的治疗效果及作用机制。[方法]将ICR小鼠置于具有低温高湿环境的人工气候箱中,滴鼻给予流感病毒(A/PR/8/34)建立流感病毒肺炎模型。造模后第5天对小鼠每日给予宣肺败毒颗粒灌胃5 d,观察记录小鼠的行为学评分、体质量、脏器指数、肺部病毒载量、肺部影像学及形态学变化,蛋白印迹法检测炎症关键蛋白NF-κB的表达变化,流式细胞术检测宣肺败毒颗粒对小鼠免疫应答的调节。[结果]与模型组相比,宣肺败毒颗粒给药后小鼠表现出活跃程度上升、大便性状正常、肺部病毒载量降低、小鼠肺部炎性渗出减少,p-NF-κB P65表达降低,CD4+和CD8+T细胞百分比增高。[结论]宣肺败毒颗粒增加T细胞数量,减轻流感病毒肺炎小鼠的炎症反应。

黄芩苷对甲型流感病毒PR8株的体外抑制作用研究

目的:研究不同来源黄芩苷对甲型流感病毒PR8株的体外抑制作用。方法:制备流感病毒空斑模型,通过预防保护(病毒吸附前给药)和治疗(病毒吸附后给药)2种模式观察黄芩苷对流感病毒不同阶段的抑制作用并结合神经氨酸酶抑制试验寻找其可能的作用位点。结果:2种受试黄芩苷样品A和样品B对MDCK细胞毒性(半数有毒浓度,TC50)分别为0.099 mg/mL和0.8 mg/mL;黄芩苷A在预防保护和治疗模式中均未发现明显的病毒抑制作用(IC50>0.3mg/mL);黄芩苷B在预防保护和治疗模式中的半数有效抑制浓度(IC50)分别为0.08和0.045mg/mL(选择指数SI为10和17.7),并对神经氨酸酶(NA)活性显示一定的抑制作用(IC50=51.7μg/mL)。结论:市售商品化黄芩苷B有确定的体外抑制流感病毒PR8株的作用。

热毒宁吸入溶液对甲型流感病毒A/PR/8/H1N1感染所致小鼠病毒性肺炎的药理作用研究

目的探讨热毒宁吸入溶液对甲型流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠致肺炎模型的药理作用,为临床应用提供基础。方法实验动物按体质量随机分为8组,分别为正常对照组、模型对照组、利巴韦林对照组、热毒宁注射给药对照组,热毒宁雾化吸入给药高剂量组0.23 g生药/kg(20 min)、中剂量组0.12 g生药/kg(10 min)、低剂量组0.06 g生药/kg(5 min)和极低剂量组0.03 g生药/kg(2.5 min)。采用甲型流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠致肺炎模型,通过检测肺指数、肺部病理变化及肺组织中病毒载量、炎症因子白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量等指标评价热毒宁吸入溶液治疗流感病毒性肺炎的药理作用。结果热毒宁吸入溶液4个剂量组均可不同程度上降低小鼠肺指数、减轻肺组织病理损伤、降低病毒载量及减少IL-6、TNF-α的含量。结论热毒宁吸入溶液雾化吸入给药对甲型流感病毒A/PR/8/H1N1感染所致小鼠病毒性肺炎具有显著治疗作用。

葛根汤颗粒治疗上呼吸道感染所致小鼠病毒性肺炎及死亡保护作用

目的:研究葛根汤颗粒对甲型H_(1)N_(1)流感病毒PR8株感染致小鼠病毒性肺炎模型的治疗及死亡保护作用。方法:采用甲型H1N1流感病毒(PR8株)滴鼻感染小鼠造成病毒性肺炎模型,观察小鼠的肺指数和肺指数抑制率,肺内细支气管及肺组织苏木精-伊红(HE)染色病理切片镜下病变观察及等级评分;同时采用流感病毒PR8毒株滴鼻感染小鼠造成死亡保护模型,观察小鼠感染后2周内的死亡情况,计算小鼠的死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率。结果:葛根汤颗粒高、中剂量组可显著降低模型组小鼠肺指数(P<0.01);葛根汤颗粒高、中剂量组与模型组比较可显著减轻支气管炎症反应渗出状况,红肿相对消退,并且缓解病毒感染所致肺泡、肺间质渗出炎症反应及红细胞渗出情况(P<0.01,P<0.05);模型组小鼠死亡率90%,平均存活天数9.95 d,葛根汤颗粒3个剂量组与模型组比较可显著降低小鼠死亡率,延长小鼠平均存活天数,提高生命延长率(P<0.01,P<0.05)。结论:本研究发现葛根汤颗粒可显著降低病毒性肺炎模型小鼠的肺指数,并显著减轻病毒感染所致的小鼠肺内细支气管及肺局部炎症反应损伤,对模型小鼠的肺部炎症反应有明显的治疗作用;同时可显著降低模型小鼠死亡率,延长平均存活天数,提高生命延长率,对感染小鼠有死亡保护作用。

清营解表合剂对感染流感病毒A/PR/8/H1N1模型小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

目的:观察清营解表合剂对A/PR/8/H1N1病毒感染小鼠的巨噬细胞吞噬功能的影响。方法:将BALB/C小鼠随机分为正常空白组(A组)、感染模型组(B组)、银翘解毒颗粒对照组(C组)、清营解表合剂中剂量组(D组)、清营解表合剂高剂量组(E组),B、C、D、E组分别以A/PR/8/H1N1株病毒液感染小鼠造模,感染0.5h后给药,A组、B组灌服生理盐水,C组灌服银翘解毒颗粒混悬液,D、E组灌服清营解表合剂混悬液,用腹腔巨噬细胞吞噬功能测定(半体内法)高倍镜下镜检吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数。结果:C、D组吞噬率、吞噬指数比B组高,有极显著性差异(P<0.01)。C组与D组比较无显著性差异(P>0.05)。结论:巨噬细胞参与感染早期一系列免疫反应,清营解表合剂能显著提高巨噬细胞的吞噬功能。

复方中药对流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染小鼠淋巴细胞功能和细胞因子的影响

目的观察复方中药对流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染小鼠淋巴细胞功能和细胞因子的影响。方法90只BALB/c小鼠随机分为6组,每组15只,分别为空白对照组、模型对照组、盐酸金刚烷胺对照组(100 mg/kg)、复方中药高剂量组(1.5 g/kg)、中剂量组(0.75 g/kg)与低剂量组(0.375 g/kg)组。中药组连续灌胃2 d后,空白对照组滴鼻生理盐水,其他5组小鼠滴鼻流感病毒感染建立流感病毒小鼠模型,模型建立4 h后空白对照组和模型对照组灌胃去离子水,药物组灌胃不同剂量药物,连续5 d。灌胃结束后无菌取血,小鼠安乐死,取胸腺和脾脏,计算胸腺指数和脾脏指数;采用MTT测定各组的T、B淋巴细胞转化率;ELISA检测肺组织中的细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平。结果与空白对照组相比,模型对照组胸腺指数和脾脏指数,T、B淋巴细胞A值,IL-10和IFN-γ显著下降,TNF-α和IL-6显著升高(P<0.01);与模型对照组相比,复方中药中剂量组胸腺指数和脾脏指数,T、B淋巴细胞A值,IL-10和复方中药高剂量组IFN-γ显著增高,复方中药中剂量组IL-6显著下降(P<0.05),复方中药中、低剂量组TNF-α显著下降,IFN-γ显著升高(P<0.01)。结论复方中药通过调节机体淋巴细胞功能和细胞因子分泌水平,从而改善肺部炎症,是治疗病毒性流感的作用机制之一。

一个复方中药处方对流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠肺损伤的影响

目的观察一个复方中药处方对流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠所致肺损伤的影响。方法将90只雌性BALB/c小鼠随机分为空白对照组、病毒对照组、盐酸金刚烷胺组和复方中药高、中、低剂量组等6组,每组15只。中药组连续灌胃2 d后,小鼠滴鼻感染建立流感病毒小鼠模型,空白对照组滴鼻生理盐水。病毒感染4 h后各组分别灌胃不同剂量药物或生理盐水,再连续灌胃5 d。感染第5天时,计算各组BALB/c小鼠肺指数,测定肺组织匀浆的血凝滴度,并观察肺组织病理形态学。结果与病毒对照组相比,盐酸金刚烷胺组和复方中药制剂中剂量组肺指数显著降低(P<0.01),复方中药制剂低剂量组和复方中药制剂高剂量组肺指数显著降低(P<0.05);各药物组小鼠肺组织血凝滴度均显著降低(P<0.01);各药物组小鼠肺组织病理形态学均有不同程度的改善。结论本研究所用的复方中药处方对流感病毒A/PR/8/H1N1感染的小鼠平均肺指数和平均血凝滴度有明显的降低作用,对其所致肺损伤有明显的改善作用。

S1PR1基因慢病毒转染对EAE小鼠调节性T细胞及IL-17、IFN-γ水平的影响

目的:观察经外周转染S1PR1基因慢病毒(LV-S1PR1)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠调节性T细胞比例及IL-17、IFN-γ水平的影响。方法:将30只健康雌性C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、EAE模型组、LV-S1PR1转染组,后两组建立EAE模型,LV-S1PR1转染组经尾静脉注射LV-S1PR1。每日进行神经功能缺损评分;免疫印迹法(Western blot)检测外周血S1PR1表达水平;ELISA法检测外周血1-磷酸鞘氨醇(S1P)水平以及脊髓组织IL-17、IFN-γ水平;流式细胞术检测脾脏中调节性T细胞的比例。结果:与EAE模型组相比较,LV-S1PR1转染组神经功能缺损症状改善;外周血S1PR1表达增加( P <0.05);外周血S1P水平、脾脏中调节性T细胞比例及脊髓组织中IL-17和IFN-γ水平降低( P <0.05)。结论:经外周转染LV-S1PR1可以改善EAE小鼠的发病,其防治作用机制可能与上调外周S1PR1的表达,降低外周S1P水平,使T细胞迁移受阻有关。

不同性别及周龄小鼠感染A/PR/8/H1N1外周血白细胞计数的对比观察

目的:观察A/PR/8/H1N1病毒感染小鼠的外周血白细胞计数的差异,探讨不同性别、周龄小鼠间的体质差异。方法:昆明种小鼠分别按雌雄及周龄分组,正常空白组以25μl生理盐水滴鼻,造模组以A/PR/8/H1N1株病毒液25μl滴鼻,在感染病毒后第3天、第6天,于小鼠眶后静脉窦采血,检测分析外周血白细胞计数。结果:感染前及感染后第3天不同周龄组小鼠间血白细胞计数有显著性差异;造模后第6天血白细胞计数雌雄小鼠间比较有显著性差异,不同周龄组小鼠间比较亦有显著性差异。结论:不同周龄组小鼠白细胞计数表现一定差异性,不同性别小鼠间差异有待进一步研究。

流感病毒为载体重组病毒株rHCV/FLU的构建及初步评价

目的构建及拯救以流感病毒为载体嵌合HCV抗原表位的重组病毒株r HCV/FLU并对其进行评价。方法利用反向遗传学技术,选择流感病毒A/Puerto Rico/8/34(PR8)为载体,将HCV 1b亚型的E1抗原基因经序列优化插入到PR8流感病毒NS1片段的特定位置,构建重组质粒p NS1-HCV,测序正确的重组质粒p NS1-HCV与PR8的7个重组质粒p HW191-PB2、p HW192-PB1、p HW193-PA、p HW194-HA、p HW195-NP、p HW196-NA、p HW197-M转染共培养的COS-1和MDCK细胞,经拯救、筛选、鉴定获得流感病毒为载体嵌合HCV抗原表位的重组病毒株,命名为r HCV/FLU,并通过血凝试验、RT-PCR、Western blot、电镜观察病毒形态等方法对重组病毒鉴定。接着,重组病毒接种SPF鸡胚扩大培养、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化。纯化获得的重组病毒抗原,滴鼻免疫Balb/c小鼠,0 d、14 d免疫2次,设置104TCID50、105TCID50、106TCID503个剂量组,初步评价其免疫效果。结果成功拯救重组病毒株r HCV/FLU,血凝效价(HA)为29-10,病毒滴度Log10(TCID50/ml)为6.5。滴鼻免疫小鼠二免后14 d取小鼠血清及脾淋巴细胞,3个剂量组针对流感病毒的血抑(HI)效价均值分别为80、640和1 280,初步证明重组病毒株r HCV/FLU在小鼠体内能够产生较强体液免疫和细胞免疫应答反应。结论成功制备的重组病毒株r HCV/FLU在动物体内具有较好的免疫效果,为新型HCV疫苗的研制提供新的研究策略。

H1N1流感病毒树鼩模型生物学特性的研究

目的建立H1N1流感病毒感染树鼩模型,探讨流感病毒动力学变化和在呼吸系统组织中的分布特征。方法选择3~3.5周岁成年树鼩(Tupaia Belangeri Chinensis)24只,雌雄各半,随机分为空白组(B组)和模型组(M组)各12只,使用H1N1流感病毒每只600μL(1×10^(6.8)TCID50/0.1 mL)经鼻腔感染M组树鼩,在-3~10 d期间每天早晨测量肛温,同时采集咽拭子、鼻拭子和血液样本测定病毒载量。并测定2、4、7 d血液中抗流感的中和抗体。2、3、5、10 d随机处死3只树鼩,采集鼻甲、气管、咽部和肺组织进行病毒载量检测,取3、5、10 d组织进行病理学检测。结果M组的树鼩表现为被毛蓬乱、食欲不振、运动迟缓、体温升高和鼻咽分泌物增加等临床症状;感染后1 d开始可以在呼吸道中检测到病毒载量,3 d血液中出现病毒载量;病理结果显示鼻甲、咽、气管和肺组织中均有一定程度的病理改变。结论树鼩感染流感病毒后出现的临床症状与人类极为相似,所建立的流感树鼩模型对研究流感的发病机制与抗流感药物评价提供了有重要价值的工具。

嵌合HAdV六邻体蛋白抗原表位的rFLU/HAdV/Hexon疫苗候选株构建及免疫效果研究

目的构建、拯救以PR8流感病毒为载体嵌合HAdV六邻体蛋白抗原表位的疫苗候选株,对其免疫原性及免疫保护性进行评价。方法应用反向遗传学技术,以流感病毒PR8为载体,将HAdV六邻体蛋白抗原表位的基因插入流感病毒非结构蛋白NS基因,构建重组质粒NS1-Hexon,将重组质粒与PR8流感病毒其他7个基因组质粒共转染COS-1/MDCK共培养细胞,成功拯救嵌合HAdV六邻体抗原表位重组疫苗候选株,命名为rFLU/HAdV/Hexon,通过HA、RT-PCR、IFA、Western blotting和电镜等方法对rFLU/HAdV/Hexon进行鉴定。rFLU/HAdV/Hexon经鸡胚培养、浓缩纯化后滴鼻免疫Balb/c小鼠,评价小鼠机体产生的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答,进一步采用PR8流感病毒和HAdV-3病毒攻击小鼠评价其免疫保护性。结果成功拯救出基于PR8流感病毒为载体嵌合HAdV六邻体蛋白抗原表位的rFLU/HAdV/Hexon疫苗候选株。rFLU/HAdV/Hexon疫苗株形态符合流感病毒典型特征,能够诱导小鼠机体产生高效价的针对PR8和HAdV-3的特异性抗体,肺鼻灌洗液可检测到高效价的sIgA抗体;攻毒实验结果显示,rFLU/HAdV/Hexon疫苗株免疫小鼠可明显减轻感染症状、有效降低肺鼻的病毒载量、显著改善肺组织的病理病变情况。结论研制的嵌合HAdV六邻体蛋白抗原表位的rFLU/HAdV/Hexon疫苗株是有发展前景的腺病毒候选疫苗株,为腺病毒疫苗的研究提供了新思路。

流感病毒PR8F的拯救及其对BALB／c小鼠的致病力

为了研究H1N1流感病毒对BALB/c小鼠的致病相关分子机制、传播机制以及开发新型疫苗,将本实验室保存的A/PR/8/34株的8个质粒参照Paulina构建的流感病毒8质粒突变系统做定点突变,利用反向遗传操作技术,成功拯救出H1N1流感病毒突变株PR8F。将PR8F株以106 TCID50/100μL的剂量滴鼻感染BALB/c小鼠,观察小鼠临床表现及体质量变化。解剖攻毒后不同时间小鼠并观察体内主要脏器的病理特征,提取各脏器RNA,通过实时荧光定量PCR方法,检测PR8F株在小鼠体内不同脏器中的病毒残留量和在BALB/c小鼠肺脏中的扩增效率。结果表明,H1N1流感病毒突变株PR8F感染小鼠4~7d后全部致死;PR8F株在小鼠体内各脏器中的病毒残留量有很大差异,肺脏中最多,且病毒在肺脏内呈指数形式扩增。本试验建立了H1N1流感病毒PR8F株对BALB/c小鼠的感染模型,为H1N1流感病毒致病机制和传播机制的研究奠定基础。

桂枝挥发油与桂皮醛对病毒性肺炎小鼠细胞因子及T细胞亚群的影响

目的:研究桂枝挥发油及主要成分桂皮醛抗甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)作用及其抗病毒作用机制。方法:KM小鼠70只随机分为7组,分别为正常组,模型组,利巴韦林组(0.15 g·kg-1),桂枝挥发油高、低剂量组(0.348,0.174mg·kg-1),桂皮醛高、低剂量组(0.264,0.132 mg·kg-1),每组10只。将浓度为30 LD50的H1N1病毒液50μL注入小鼠气管,复制病毒性肺炎模型小鼠,观察连续ig给药5 d对模型小鼠肺组织血凝滴度的抑制作用;ELISA法观察上述组别连续ig给药5 d对模型小鼠血清细胞因子白细胞介素-2(IL-2),IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌量的影响;流式细胞仪法测定桂枝挥发油0.348 mg·kg-1,桂皮醛0.264 mg·kg-1,正常组,模型组及利巴韦林组连续ig给药5 d对模型小鼠外周血T细胞亚群的影响。结果:与正常组比较,模型组小鼠肺组织血凝滴度,小鼠血清IL-6,TNF-α含量明显升高,小鼠外周血CD4+/CD8+,小鼠血清IL-2含量明显降低(P<0.05);与模型组比较,桂枝挥发油0.348 mg·kg-1,桂皮醛0.264 mg·kg-1能明显降低模型小鼠肺组织血凝滴度(P<0.05),桂皮醛0.264 mg·kg-1和桂枝挥发油0.348 mg·kg-1分别显著降低模型小鼠血清IL-6,TNF-α含量(P<0.05),桂皮醛0.264 mg·kg-1可使模型小鼠外周血CD4+/CD8+明显升高(P<0.05),各药物对小鼠血清IL-2含量的影响并不明显。结论:桂枝挥发油、桂皮醛治疗给药能明显降低模型小鼠肺组织血凝滴度,表现出较好的抗流感病毒作用。抗病毒机制与调控模型小鼠血清细胞因子IL-2,IL-6,TNF-α分泌水平及提高外周血T细胞亚群的比例有关。

复方一枝蒿微丸抗甲型H1N1流感病毒的研究

目的:观察复方一枝蒿微丸抗甲型HlNl流感作用,为临床治疗流感提供试验依据。方法:体外试验,以甲型HlNl流感病毒致人喉癌上皮细胞(Hep-2)病变,采用Reed-Muench法计算半数有毒浓度(TC_(50))、最大无毒浓度(TC_0)、半数抑制浓度(IC_(50))和治疗指数(SI);体内试验,以甲型H1N1流感病毒鼠肺适应株PR8滴鼻感染小鼠,计算小鼠存活率、存活天数及肺指数。结果:复方一枝蒿微丸对甲型H1N1流感病毒的TC_(50)为198.6 mg/ml,TC_0为18.2 mg/ml,IC_(50)为8.6±1.85 mg/ml,SI为41.5;复方一枝蒿微丸能降低感染甲型H1N1流感病毒的小鼠死亡率,抑制流感病毒所致的小鼠肺损伤。结论:复方一枝蒿微丸具有明显的抗甲型H1N1流感病毒作用。