PR结构域蛋白5过表达对人急性髓系白血病细胞系U937迁移侵袭的影响及其机制

目的探讨PR结构域蛋白5(PRDM5)过表达对人急性髓系白血病(AML)细胞系U937迁移侵袭的影响及其机制。方法收集20例AML患者(AML组)和20例健康志愿者(正常组),采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测其骨髓样本中微小RNA(miR)-489-3p和PRDM5 mRNA表达水平。采用脂质体转染技术将人AML细胞系U937分为7组:pcDNA3.1组、pcDNA3.1-PRDM5组、shNC组、shPRDM5组、NC组、miR-489-3p mimics组和miR-489-3p+pcDNA3.1-PRDM5组,采用划痕实验和侵袭迁移小室(Transwell小室)法分别检测各组细胞的迁移和侵袭能力;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测β-catenin和GSK3β蛋白表达水平。结果AML组受试者骨髓miR-489-3p表达水平低于正常组,PRDM5 mRNA表达水平高于正常组(P<0.05)。pcDNA3.1-PRDM5组和miR-489-3p+pcDNA3.1-PRDM5组PRDM5 mRNA、β-catenin表达水平、穿过基质胶膜的细胞数量及24 h内迁移率分别高于pcDNA3.1组、miR-489-3p mimics组,而GSK3β表达水平分别低于pcDNA3.1组、miR-489-3p mimics组(P<0.05)。shPRDM5组和miR-489-3p mimics组的PRDM5 mRNA、β-catenin表达水平、穿过基质胶膜的细胞数量及24 h内迁移率分别低于shNC组和NC组,而GSK3β蛋白表达水平分别高于shNC组和NC组(P<0.05)。结论miR-489-3p靶向PRDM5基因阻断Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制人AML细胞系U937迁移侵袭。

miR-592靶向调控PRDM5影响肾细胞癌侵袭转移及自噬的机制研究

目的探究miR-592靶向调控PR结构域锌指蛋白5(PR domain zinc finger protein 5,PRDM5)影响肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)侵袭转移及自噬的机制。方法RT-qPCR、蛋白质印迹检测RCC组织和细胞中miR-592、PRDM5 mRNA和蛋白水平。A498、786-O细胞分为anti-miR-NC组、anti-miR-592组、anti-miR-592+si-NC组、anti-miR-592+si-PRDM5组。RNA免疫共沉淀(RIP)检测miR-592和PRDM5的结合;CCK-8、Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;透射电镜观察自噬小体形成;蛋白质印迹检测细胞PRDM5、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ水平。建立移植瘤裸鼠模型,分析敲低miR-592表达对移植瘤生长的影响。结果RCC组织和细胞中PRDM5 mRNA和蛋白水平降低,miR-592水平增加(P<0.05)。敲低miR-592表达后,细胞A_(450 nm)、迁移和侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9水平降低,自噬小体数量、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平增加(P<0.05)。敲低PRDM5表达能部分逆转敲低miR-592对细胞增殖、侵袭及自噬的影响(P<0.05)。敲低miR-592表达能够抑制裸鼠移植瘤生长(P<0.05)。结论miR-592通过靶向抑制PRDM5表达,促进RCC细胞增殖、侵袭转移能力,并抑制自噬能力。

含PR结构域的锌指蛋白5特异性小干扰RNA载体构建及干扰效果评价

目的构建含PR结构域的锌指蛋白5(PRDM5)特异性小干扰RNA(siRNA)干扰载体并鉴定其干扰效果。方法根据小鼠PRDM5基因全长c DNA序列,设计合成6条siRNA干扰片段(si PRDM5-1、si PRDM5-2、si PRDM5-3、si PRDM5-4、si PRDM5-5和si PRDM5-6)和2条对照序列(si CTL-1和si CTL-2),并将前3条干扰片断和si CTL-1克隆插入p Silencer3.1-U6,另3条干扰片断和si CTL-2插入p Silencer4.1-CMV干扰载体中,构建小鼠PRDM5基因的siRNA真核表达载体si PRDM5-1、si PRDM5-2、si PRDM5-3、si PRDM5-4、si PRDM5-5和si PRDM5-6,2个对照序列si CTL-1和si CTL-2,并通过双酶切和测序进行验证,构建成功后转染小鼠黑色素瘤细胞B16F10并采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot法检测其干扰效率。结果成功构建真核siRNA表达载体,并且所构建的6个干扰载体均可降低小鼠黑色素瘤细胞中PRDM5基因mRNA表达(P<0.05)。其中si PRDM5-2和si PRDM5-6载体干扰效果最好。结论成功筛选出PRDM5特异性siRNA载体,为之后研究锌指蛋白基因PRDM5在小鼠黑色素瘤转移过程中功能及分子机制打下基础。

丁基苯酞通过PRDM5改善氧化应激引起的神经元细胞凋亡

目的探讨丁基苯酞对氧化应激诱导的神经元细胞PC-12凋亡的影响及其作用机制。方法将PC-12细胞分成Vector组[二甲基亚砜(DMSO)+转染vector质粒]、丁基苯酞+vector组(DMSO+25μmol·L^(-1)丁基苯酞+转染vector质粒)、PRDM5组[DMSO+转染PR结构域蛋白5(PRDM5)过表达质粒]、丁基苯酞+PRDM5组(DMSO+25μmol·L^(-1)丁基苯酞+转染PRDM5过表达质粒)。用流式细胞术检测神经元细胞的凋亡水平;用蛋白质印迹法检测切割的胱天蛋白酶3(Cleaved-caspase 3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bax)的表达水平;用分子对接分析丁基苯酞与PRDM5的结合位点。结果Vector组、丁基苯酞+vector组、PRDM5组、丁基苯酞+PRDM5组的细胞凋亡水平分别为(63.52±5.72)%、(20.48±3.56)%、(79.48±8.13)%和(22.58±3.01)%;Cleaved-caspase 3表达水平分别为0.89±0.09、0.29±0.03、1.12±0.09和0.31±0.05;Bcl-2表达水平分别为0.31±0.02、0.79±0.05、0.12±0.01和0.89±0.11;Bax表达水平分别为0.83±0.08、0.25±0.03、1.03±0.11和0.27±0.03。Vector组的上述指标与PRDM5组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。丁基苯酞与PRDM5存在结合(自由能为-12.55 kcal·mol-1),结合位点为K413和D414。结论丁基苯酞与PRDM5的K413R和D414A结合,抑制了PRDM5的功能进而改善了氧化应激引起的神经元细胞凋亡。