敲除组蛋白甲基转移酶PR结构域锌指蛋白9抑制牙周膜干细胞成骨向分化

目的研究组蛋白甲基转移酶PR结构域锌指蛋白9(PR domain zinc finger protein 9,PRDM9)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell,PDLSC)成骨向分化的影响.方法将与PRDM9序列互补的短发夹RNA亚克隆到含有绿荧光蛋白的慢病毒载体中,利用重组慢病毒敲除PDLSC中的PRDM9基因,形成敲除组(简称PRDMsh组),转染空载体sh RNA作为对照组;应用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测PRDM9基因的敲除效率;通过碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性测定、茜素红染色和钙离子定量分析检测敲除组PRDM9sh与对照组细胞成骨能力的差异;通过实时定量RT-PCR及蛋白免疫印迹实验检测敲除组PRDM9sh和对照组成骨分化指标骨钙蛋白在mRNA水平及蛋白水平的表达差异;通过裸鼠皮下移植物HE染色比较敲除组PRDM9sh及对照组体内成骨能力,计算新成骨组织面积百分比并进行统计学分析.结果实时定量RT-PCR结果显示,敲除组PRDM9sh中PRDM9基因的相对表达量(0.460±0.017)显著低于对照组(1.000±0.107)(P<0.05);成骨诱导5d后,敲除组PRDM9sh的ALP活性(0.762±0.063)显著低于对照组(1.225±0.058)(P<0.01);成骨诱导2、3周后,茜素红染色结果显示,与对照组相比敲除组PRDM9sh染色明显变浅;成骨诱导2、3周后,敲除组PRDM9sh钙离子含量[分别为(0.071±0.004)、(0.075±0.001)]较对照组[分别为(0.282±0.006)、(0.485±0.004)]显著降低(P<0.01);RT-PCR结果显示成骨2周时,敲除组PRDM9sh骨钙蛋白mRNA水平的相对表达量(1.059±0.148)显著低于对照组(2.542±0.190)(P<0.01);蛋白质印迹法结果显示成骨诱导1、2周时,敲除组PRDM9sh骨钙蛋白的蛋白水平表达明显弱于对照组;裸鼠皮下移植物HE染色及计算新成骨组织面积百分比结果显示敲除组PRDM9sh新成骨组织面积百分比[(3.8±2.41)%]较对照组[(24.54±7.06)%]显著降低(P<0.05).结论敲除PRDM9基因可以抑制牙周膜干细胞的体内外成骨分化功能.

miR-592靶向调控PRDM5影响肾细胞癌侵袭转移及自噬的机制研究

目的探究miR-592靶向调控PR结构域锌指蛋白5(PR domain zinc finger protein 5,PRDM5)影响肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)侵袭转移及自噬的机制。方法RT-qPCR、蛋白质印迹检测RCC组织和细胞中miR-592、PRDM5 mRNA和蛋白水平。A498、786-O细胞分为anti-miR-NC组、anti-miR-592组、anti-miR-592+si-NC组、anti-miR-592+si-PRDM5组。RNA免疫共沉淀(RIP)检测miR-592和PRDM5的结合;CCK-8、Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;透射电镜观察自噬小体形成;蛋白质印迹检测细胞PRDM5、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ水平。建立移植瘤裸鼠模型,分析敲低miR-592表达对移植瘤生长的影响。结果RCC组织和细胞中PRDM5 mRNA和蛋白水平降低,miR-592水平增加(P<0.05)。敲低miR-592表达后,细胞A_(450 nm)、迁移和侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9水平降低,自噬小体数量、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平增加(P<0.05)。敲低PRDM5表达能部分逆转敲低miR-592对细胞增殖、侵袭及自噬的影响(P<0.05)。敲低miR-592表达能够抑制裸鼠移植瘤生长(P<0.05)。结论miR-592通过靶向抑制PRDM5表达,促进RCC细胞增殖、侵袭转移能力,并抑制自噬能力。

含PR结构域的锌指蛋白5特异性小干扰RNA载体构建及干扰效果评价

目的构建含PR结构域的锌指蛋白5(PRDM5)特异性小干扰RNA(siRNA)干扰载体并鉴定其干扰效果。方法根据小鼠PRDM5基因全长c DNA序列,设计合成6条siRNA干扰片段(si PRDM5-1、si PRDM5-2、si PRDM5-3、si PRDM5-4、si PRDM5-5和si PRDM5-6)和2条对照序列(si CTL-1和si CTL-2),并将前3条干扰片断和si CTL-1克隆插入p Silencer3.1-U6,另3条干扰片断和si CTL-2插入p Silencer4.1-CMV干扰载体中,构建小鼠PRDM5基因的siRNA真核表达载体si PRDM5-1、si PRDM5-2、si PRDM5-3、si PRDM5-4、si PRDM5-5和si PRDM5-6,2个对照序列si CTL-1和si CTL-2,并通过双酶切和测序进行验证,构建成功后转染小鼠黑色素瘤细胞B16F10并采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot法检测其干扰效率。结果成功构建真核siRNA表达载体,并且所构建的6个干扰载体均可降低小鼠黑色素瘤细胞中PRDM5基因mRNA表达(P<0.05)。其中si PRDM5-2和si PRDM5-6载体干扰效果最好。结论成功筛选出PRDM5特异性siRNA载体,为之后研究锌指蛋白基因PRDM5在小鼠黑色素瘤转移过程中功能及分子机制打下基础。

PRDM家族蛋白结构与功能研究进展

PRDM家族蛋白是具有一个PR结构域和数量不等锌指结构(除了PRDM11),广泛存在于灵长类、啮齿动物、鸟类和两栖动物中能够调控表观遗传的蛋白。部分PRDM蛋白家族成员的PR结构域具有组蛋白赖氨酸转移酶活性(HMT),影响表观遗传,PRDM蛋白锌指结构具有DNA、RNA、蛋白识别结合能力;另一部分PRDM家族成员虽然具有PR结构域,但不具有HMT活性,在癌症发生、原始生殖细胞特化、神经系统发育、造血、血管发展、胚胎发育中发挥重要作用。PRDM家族蛋白通过甲基转移或募集染色体结构重塑复合物,调控基因表达和修改染色体结构,在细胞特化和疾病调控中起到重要作用。论文综述了PRDM家族蛋白结构与功能最新研究进展。

白色脂肪组织棕色化调控机制的研究进展

脂肪组织棕色细胞和白色细胞具有截然不同的代谢特征。白色脂肪细胞推动动脉粥样硬化的形成与发展,而棕色脂肪细胞在动脉粥样硬化的防治中发挥重要作用,两者可以相互转化。文中从转录因子(如PPARγ、PRDM16、PGC-1α)、共调节因子、激素、信号分子、氧化应激和miRNAs的调控等方面对白色脂肪组织棕色化调控机制作一综述。