猕猴桃病程相关蛋白PR-1基因的克隆和功能分析

【目的】探究猕猴桃病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)PR-1基因在响应丁香假单胞杆菌中的功能。【方法】以毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)为材料,克隆得到PR-1同源基因AePR-1全长序列,并对其序列进行生物信息学分析。采用实时荧光定量方法检测AePR-1基因在不同组织、花器官以及接种细菌性溃疡病菌(Psa)和不同激素(SA、ABA、GA3)处理条件下的表达情况。利用亚细胞定位技术分析AePR-1基因在细胞中的表达位置。通过在本氏烟草中过表达AePR-1基因,验证其在溃疡病菌响应过程中的功能。【结果】猕猴桃AePR-1基因序列全长522 bp,编码173个氨基酸,序列中含有6个保守的半胱氨酸结构基序和4个allergen V5/Tpx-1 related保守结构域。亚细胞定位发现AePR-1定位在细胞膜和细胞质中。AePR-1在猕猴桃根和雌蕊中高表达,且能够响应溃疡病菌及激素处理。过表达AePR-1的烟草在接种溃疡病菌后,叶片病斑数明显少于对照组。【结论】AePR-1基因在溃疡病菌和激素诱导下显著表达且过表达能够增强烟草对溃疡病的抗性,说明猕猴桃PR-1基因在响应生物和非生物胁迫中具有重要作用。

多梳抑制性去泛素化酶复合物的结构与功能及其在血液肿瘤发生发展中的作用

多梳抑制性去泛素化酶(polycomb repressive deubiquitinase,PR-DUB)复合物是多梳蛋白家族的成员之一,通过调节组蛋白修饰参与染色体的表观遗传修饰。多梳抑制性复合物1(polycomb repressive complex 1,PRC1)和PR-DUB复合物通过对H2AK119Ub泛素化与去泛素化修饰调控平衡,保护活性基因免受异常沉默,去泛素化功能与促进基因活化和建立转录允许的染色质状态有关,除此之外还激活增强子并促进双链断裂处DNA损伤修复。附加性梳样1(additional sex comb-like1,ASXL1)作为表观遗传支架组装染色质修饰复合物和转录因子参与表观遗传调控。BRCA1相关蛋白1(BRCA1-associated protein 1,BAP1)作为去泛素化酶去除底物的泛素化修饰。PR-DUB复合物由核心二聚体和其他辅助因子组成,BAP1与ASXL1形成核心二聚体,其他亚基相互作用调节PR-DUB复合物靶向和功能。ASXL1和BAP1是与PR-DUB复合物去泛素化功能最相关的2个亚基,ASXL1的DEUBAD结构域激活BAP1发挥去泛素化作用水解H2AK119Ub1。了解ASXL1和BAP1的结构以及相互作用机制对研究PR-DUB复合物特异性去泛素化作用的机制至关重要。在人类中,PR-DUB复合物成分的突变经常引起多种血液肿瘤。ASXL 1基因突变常导致蛋白质翻译提前结束,大部分是由于C末端PHD结构域缺失导致。目前认为,PR-DUB复合物中突变的ASXL1或BAP1、表观遗传因子以及Akt/mTOR等靶点或信号通路相互作用是促进血液肿瘤发生发展的可能机制。这对于针对潜在的治疗靶点研究开发新的特异性靶向治疗药物至关重要。本文将介绍PR-DUB复合物的结构与功能、作用机制及其在血液肿瘤疾病中的发生,重点就ASXL1和BAP1进行综述,并系统总结了潜在的靶向治疗药物,以期为PR-DUB复合物在血液疾病防治中的研究提供科学参考。

拟南芥NPR1基因的克隆与表达载体的构建

NPR1基因为植物抗病基因表达和系统获得性抗性中的一个关键基因。该文以DNA PCR扩增的方法,从拟南芥基因组DNA中克隆出NPR1基因,通过序列分析,所克隆的 NPR1 基因与报道的基因序列完全一致。将其构建成植物表达载体,为今后植物抗病基因工程的开展奠定了基础。

水稻纹枯病发病过程PR1和PBZ1的表达动态

采用从福建省稻田分离纯化的纹枯病菌(Rhizoctonia so lani)菌株FJ-15接种籼稻9311,分析了水稻在纹枯病菌侵染致病过程中,编码病程相关蛋白的基因表达动态,并观察了症状的变化。Northern b lot分析表明:PR1在接种12 h后开始表达,在之后的4个时间段其表达量逐步增强;而PBZ1也在12 h开始表达,在48 h表达量激剧增强几乎与72 h表达量相当。组织和症状观察表明,接种12 h后叶鞘表面菌丝纵横分枝,接种36 h后出现零星病斑,接种48 h后表现典型的受害症状,接种72 h后病斑继续扩大,并可蔓延到非接种叶鞘。结果表明,PR1和PBZ1的表达与水稻和纹枯病菌亲和互作的过程存在对应关系。

甘蓝型油菜BnERF104超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

根据拟南芥乙烯响应因子AtERF104的序列设计保守引物,从甘蓝型油菜品种中双9号中克隆到同源基因BnERF104。序列分析表明BnERF104蛋白含有一个典型的ERF domain保守结构域,属于乙烯响应转录因子ERF家族的成员。甘蓝型油菜用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)接种6h后,BnERF104基因被诱导显著上调表达。BnERF104基因在转基因拟南芥中的超表达提高了病原相关蛋白(PR)防御素PDF1.2和几丁质酶ChiB基因的表达量,显著增强了对腐生营养型真菌核盘菌的抗性。

Os WRKY80基因参与调控水稻抗病反应研究

为进一步了解Os WRKY80基因参与调控的抗病分子机理,对Os WRKY80增强表达转基因水稻和干涉转基因水稻进行稻瘟病抗性检测,Northern杂交分析Os WRKY80基因和PR基因(ZB8、PBZ1)稻瘟病接种0 h和24 h时的表达情况。结果表明:与干涉转基因水稻和未转基因对照相比,增强表达转基因水稻表现出对稻瘟病有较好的抗性。Northern杂交结果显示,在干涉转基因植株中内源Os WRKY80基因的诱导表达被抑制,转基因植株的抗病性与Os WRKY80基因的表达呈一定的正相关性。在干涉转基因植株中均未检测到ZB8和PBZ1的表达,稻瘟病诱导24 h时,未转基因植株和增强转基因植株中均能检测到ZB8、PBZ1诱导型表达,但在增强转基因植株中ZB8、PBZ1的诱导表达丰度要显著高于未转基因植株。这表明Os WRKY80基因可能作为正调控因子参与水稻防卫反应,PR基因的高水平诱导表达导致增强表达转基因植株对稻瘟病的抗性增强。

乙肝表面抗原大蛋白(S1S2S)基因在转基因苹果中表达

构建了乙肝表面抗原大蛋白基因PRS-S1S2S的表达载体pYF9616,通过根癌农杆菌介导法首次将该基因导入苹果品种红爱佳中,得到了抗卡那霉素的GUS阳性转化植株。随机取3株GUS染色阳性的转基因苹果植株经PCR扩增及RT-PCR检测证实该基因已整合入转基因苹果的基因组,并在转录水平得到了表达,ELISA检测证明在苹果植株中正确表达了乙肝表面抗原大蛋白基因。

大豆GmPR10基因克隆与植物表达载体的构建

为探明大豆中PR10蛋白质基因的抗大豆花叶病毒(SMV)作用机理,从抗SMV材料中克隆到GmPR10基因完整的cDNA序列,GmPR10基因的开放阅读框(ORF)全长477 bp,编码158个氨基酸。序列比对与进化树分析结果表明:GmPR10是大豆中一个新的PR10蛋白质基因,GmPR10基因在大豆的根、茎、叶中均能表达,接种大豆SMV后该基因在大豆叶片中被强烈诱导并高效表达,推测其可能使植物本身获得系统抗性以抵抗外来病原菌的侵袭。该研究构建了GmPR10基因的植物表达载体,为探究GmPR10基因在大豆抗病中的分子作用机理打下了基础。

番茄PR-1和PR-5基因的表达特性分析

分别克隆番茄PR-1和PR-5基因片段,并以之制备探针,采用Northern blot方法研究了PR-1和PR-5基因在正常生长条件下番茄根、茎、叶、果实发育中的表达模式,研究了干旱、复水和内外源乙烯对这两种基因表达的影响.结果表明:这两个基因主要在衰老叶片、B期果实和根部表达,干旱抑制了这两个基因的表达,复水和乙烯诱导其表达.

Pti5基因植物双元表达载体的构建及鉴定

Pto基因编码丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 ,对番茄细菌病具有良好抗性。Pti5是与Pto互作的蛋白质 ,Pti5蛋白与广泛存在的病程相关蛋白基因 (PR基因 )中的顺式元件相结合 ,可增强PR基因的表达 ,为提高植物抗病性提供了有效的途径。本研究将Pti5基因构建到植物双元表达载体 pBI12 1上 ,获得pBI12 1UCH1重组质粒 ,并将该质粒转化到根癌农杆菌LBA4 4 0 4中 。

环境胁迫和乙烯对番茄PR-NP24基因表达的影响

根据已报道的番茄PR-NP24基因序列设计引物,经PCR克隆出长为477bp的番茄PR-NP24基因片段,以该片段制备探针,采用Northern杂交技术对该基因在番茄(WT)和乙烯反应突变体番茄(Nr,rin,T4B-11)中的表达进行了研究.杂交结果表明,该基因主要在果实和根部表达,伤害抑制WT、Nr番茄叶片中该基因的表达,而对rin番茄叶片无明显影响;干旱、淹水等环境胁迫和乙烯均能不同程度地诱导其表达,而在不同温度下,PR-NP24基因表达变化不大.

谷氨酰胺对断奶仔猪抗菌肽PR-39 mRNA的表达调控

本文旨在探讨谷氨酰胺(Gln)对断奶仔猪抗菌肽PR-39 mRNA表达的影响。选取64头胎次相同、28日龄断奶、体重(7.50±0.67)kg的三元杂交仔猪(杜×长×大),随机分为2个组,即基础日粮对照组和1.0%Gln添加组,每组设4个重复,每个重复8头猪(公母各1/2)。于试验第28天,进行细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的分析。于第30天,采用半定量RT-PCR研究日粮中添加Gln对PR-39 mRNA的影响。试验结果表明:Gln添加显著提高仔猪血清中IL-1β含量(P<0.05),但对血清IL-6和TNF-α及空肠黏膜TNF-α、IL-2无显著影响(P>0.05);显著促使骨髓、空肠黏膜中PR-39 mRNA的表达(P<0.05),与对照组相比,骨髓和空肠黏膜中PR-39 mRNA分别提高50.5%(P<0.05)和24.0%(P<0.05)。由结果可知,断奶仔猪日粮中添加Gln能显著促使骨髓及空肠黏膜PR-39 mRNA表达上调。

小麦PR-1、PR-2、PR-5基因的白粉菌和水杨酸诱导表达分析及白粉病抗性研究(英文)

病程相关蛋白基因PR-1、PR-2和PR-5是植物抗病基因介导的抗病反应和系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR)中的标志基因。为了研究病程相关蛋白基因和水杨酸在小麦(TriticumaestivumL.)抗白粉病反应中所起的作用,以抗白粉病和感白粉病小麦品系为材料,在白粉病菌(Blumeria graminisf.sp.tritici,Bgt)诱导不同时间,或水杨酸处理不同时间后,用半定量RT-PCR技术检测了小麦叶片中PR-1、PR-2和PR-5基因的表达变化。结果表明,白粉病菌的侵染激活和显著增强了病程相关蛋白基因PR-1、PR-2和PR-5在周麦18中的转录。与感病品系相比,PR-1和PR-5在抗病品系中转录激活得更快、更强。水杨酸处理显著激活了PR-1和PR-5的转录,但对PR-2的转录影响不大。白粉病菌和水杨酸均能显著激活和增强PR-1和PR-5的表达,但白粉病菌的作用更强,说明PR-1和PR-5基因在小麦抗白粉病反应中起重要作用。PR-1和PR-5可以作为小麦SAR的标志基因。水杨酸处理后周麦18和中国春的白粉病抗性得到提高,提示水杨酸在小麦抗白粉病信号传导途径中起一定作用。

猪肠道抗菌肽PR-39基因克隆及序列分析

从杜长大猪的骨髓中提取基因组RNA,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增,获得一条349bp的片段,克隆于pGEM-TVector后进行序列分析结果表明,该片段为PR-39基因cDNA的部分序列,编码113个氨基酸组成的多肽,是成熟肽的主体部分.本研究得到的基因片段与报道的猪PR-39cDNA部分序列完全一致.

乳腺癌雌孕激素受体和c-erbB-2癌基因表达的临床意义

目的研究乳腺癌雌孕激素受体及cerbB2癌基因蛋白的表达情况及其临床意义。方法应用免疫组化技术研究了164例乳腺癌雌孕激素受体、cerbB2癌基因的表达。结果ER、PR的表达与腋淋巴结状况关系不大,但与临床分期呈明显负相关。癌基因cerbB2的阳性表达率与临床分期呈显著正相关。结论ER、PR的阳性表达是乳腺癌预后良好的指标,cerbB2的阳性表达是乳腺癌预后不良的指标。

c-erbB-2、ER、PR在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的探讨c-erbB-2、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)在乳腺癌中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化方法检测54例乳腺癌患者中c-erbB-2、ER、PR的表达,并分析其与临床的关系。结果54例乳腺癌中,ER、PR、c-erbB-2的阳性表达率分别为48.2%(26/54)、53.7%(29/54)、72.2%(39/54)。ER、PR的阳性表达率与患者年龄、有无淋巴结转移及组织学类型的差异无统计学意义(P>0.05);c-erbB-2阳性表达率与有无淋巴结转移的差异有统计学意义(P<0.05),与患者年龄、肿瘤体积及组织学类型的差异无统计学意义(P>0.05);ER、PR与c-erbB-2表达一致率为46.3%(25/54),表达不一致率为27.8%(15/54),ER、PR表达与c-erbB-2表达无显著相关性(P>0.05)。结论c-erbB-2的阳性表达是乳腺癌患者预后差的指标,联合检测ER、PR更有助于乳腺癌患者临床疗效和预后的判断。

日龄对仔猪股骨骨髓组织抗菌肽PR-39 mRNA表达的影响

为探明日龄对仔猪非特异性免疫形成的影响,分别于仔猪出生当天,3,14,23,28 d,随机屠宰杜长大仔公猪4头,采集股骨骨髓组织.用一优化的RT-PCR方法,以18S rRNA作内标,半定量分析不同日龄仔猪骨髓组织抗菌肽PR-39 mRNA表达的差异.结果表明:不同日龄间仔猪骨髓组织PR-39 mRNA相对表达量存在明显的差异.出生时最低,吮吸初乳2 d后显著增加,14日龄时较3日龄显著下降,随后随日龄的增加,其表达量呈上升趋势.

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的基因克隆与表达

目的 克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白基因napA ,为研究幽门螺杆菌致病机理提供材料。方法 用PCR从幽门螺杆菌DNA中扩增出目的基因napA ,定向插入原核表达载体pQE30中 ,测序分析确认后 ,转化大肠杆菌DH5α ,IPTG诱导表达 ,表达蛋白以NI2 + NTA柱进行纯化。结果 PCR扩增出 4 35bp目的基因片段napA ,克隆入pQE30质粒。工程菌诱导后SDS -PAGE显示新生表达蛋白带 ,相对分子质量为 170 0 0 ,与预期一致 ,约占菌体总蛋白的 38% ,经Ni2 + NTA柱纯化后可获得纯度为 95 5 %重组蛋白。Westernblot显示重组蛋白具有良好的抗原性。结论 克隆napA基因成功 ,并在大肠杆菌DH5α中高效表达。

乳腺癌组织中ER、PR、cerbB-2、Ki-67表达及其意义

目的探讨乳腺癌组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、cerbB-2和Ki-67基因的表达及其临床意义。方法采用S-P免疫组化方法,检测107例乳腺癌组织中ER、PR、cerbB-2、Ki-67的表达水平,并结合其患者的相关临床资料进行分析。结果乳腺癌组织中ER、PR、cerbB-2、Ki-67阳性表达率分别为56.1%、82.2%、71.0%、67.3%。ER、PR、cerbB-2、Ki-67阳性表达与乳腺癌腋窝淋巴结转移和临床分期显著相关(P<0.05)。而与患者年龄、肿瘤大小无相关性(P>0.05)。相关分析结果显示ER与PR表达呈正相关(P=0.000),与Ki-67表达呈负相关(P=0.000);PR与cerbB-2、Ki-67表达呈负相关(P=0.012、0.006)。结论 ER、PR和cerbB-2、Ki-67与乳腺癌的发生、发展有关,联合检测ER、PR、cerbB-2和Ki-67,有助于客观评估乳腺癌的生物学行为,从而指导临床治疗和预后判断。

DHA-1型质粒AmpC酶调控因子AmpR基因检测

目的检测DHA-1型质粒AmpC酶诱导性耐药调控因子AmpR基因。方法以我院临床分离产DHA-1型质粒AmpC酶的4株大肠埃希菌和10株肺炎克雷伯菌为研究对象,采用聚合酶链反应(PCR),用特异性引物扩增Am-pR调节因子全编码基因,并将一株肺炎克雷伯菌AmpR基因克隆到pET-22b(+)载体质粒中测序。结果所有实验菌株AmpR基因检测阳性,重组子AmpR基因测序表明与摩根摩根菌染色体上AmpR基因同源性达99.8%。结论产DHA-1型质粒AmpC酶肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌的质粒上存在调控因子AmpR基因。