PRKAG2基因G100S新突变对心肌细胞钙稳态和糖原含量的影响

目的探讨首次在国人WPW综合征(PRKAG2心脏综合征)家系中发现的一个新的错义突变PRKAG2 G100S引起心肌肥厚的可能机制。方法使用Invitrogen的GatewayTM重组系统构建含有人全长PRKAG2基因新突变体(PRKAG2 G100S)的重组腺病毒载体;以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,将病毒分别感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞和SD乳鼠心肌细胞后采用蛋白质印迹方法检测PRKAG2蛋白的表达。重组腺病毒感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞48h前后以Rohd-2/AM孵育并测定细胞内游离Ca2+浓度;感染乳鼠心肌细胞48～72h后以过碘酸-雪夫(PAS)法测定细胞内糖原含量。结果重组腺病毒分别感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞和SD乳鼠心肌细胞48h后荧光显微镜下可观察到绿色荧光,用PRKAG2单抗能检测到靶蛋白。与野生型PRKAG2和EGFP组比较,重组腺病毒感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞48h后突变体PRKAG2 G100S组细胞内游离Ca2+浓度无明显变化;重组腺病毒感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞48h前后的细胞内游离Ca2+浓度无明显变化。在重组腺病毒感染乳鼠心肌细胞48h后,PRKAG2 G100S组能检测到明显的心肌细胞内糖原累积。结论 PKRAG2G100S新突变导致心肌肥厚的主要发病机制可能是细胞内糖原累积,Ca2+及其介导的细胞内信号转导途径可能未参与心肌肥厚的发生。

PRKAG2基因多态性及其与北京鸭经济性状的关联分析

本研究利用PCR-SSCP及DNA测序技术对334个北京鸭个体已报道的重要能量代谢调控基因——PRKAG2基因进行遗传变异的检测,分析其多态性,并使用SPSS 19.0将北京鸭的经济性状与PRKAG2多态性进行了关联分析。结果表明,在北京鸭PRKAG2基因位点发现1个SNP(A>G),该位点位于PRKAG2基因3′-非翻译区,有3种基因型:AA、AB、BB,其中AA基因型为优势基因型。与经济性状的相关性分析发现,PRKAG2基因的遗传多态性对北京鸭的18日龄重、胸宽有极显著影响(P<0.01),对龙骨长有显著影响(P<0.05),可作为北京鸭分子育种的辅助标记,也可为改善鸭性能提供参考。

人PRKAG2(R302Q)突变型SD乳鼠心肌细胞模型的建立及检测

目的包装人PRKAG2(R302Q)突变型的腺病毒后感染原代SD乳鼠心肌细胞,构建细胞模型。方法首先通过BP及LR重组获得人PRKAG2(R302Q)突变型的腺病毒表达载体,将其线性化转染293细胞进行腺病毒包装和扩增。收集纯化腺病毒液感染原代SD乳鼠心肌细胞后进行蛋白质印迹法检测。结果 PRKAG2(R302Q)突变型的腺病毒载体经测序验证插入序列正确,腺病毒感染乳鼠心肌细胞后蛋白质印迹法检测其过表达明显(P<0.05)。结论包装人PRKAG2(R302Q)突变型基因的腺病毒并成功感染SD乳鼠心肌细胞,为进一步研究基因PRKAG2(R302Q)突变体的功能奠定了基础。

突变型人PRKAG2基因的克隆及其表达载体构建

目的构建含有定点突变的人PRKAG2基因表达载体。方法首先应用Trizol法抽提健康人全血mRNA,通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)克隆得到野生型人PRKAG2 cDNA;继而通过聚合酶链反应(PCR)定点突变的方法获得突变型人PRKAG2基因,命名为G100S,最后应用酶切连接的方法得到重组载体pEGFP-G100S。结果Trizol法提取人细胞mRNA,经RT-PCR合成cDNA第一条链,特异性引物PCR扩增得到PRKAG2基因片段,目的片段条带在1 761 bp左右。分段克隆得到的G100S片段分别为300 bp与1 500 bp左右。转化Top10感受态细菌,PCR筛选阳性菌落5个克隆有3个克隆可见1 800 bp左右的阳性片段,筛选得到pEGFP-G100S重组阳性克隆。测序证实重组载体pEGFP-G100S构建成功。结论构建的含定点突变人PRKAG2基因重组载体pEGFP-G100S为进一步研究基因PRKAG2 G100S突变的功能奠定了基础。

突变型人PRKAG2基因的克隆及其真核表达载体构建

目的构建含有突变位点R302Q的PRKAG2的真核表达载体。方法首先通过RT-PCR获得人PRKAG2的基因序列,然后采用PCR定点突变获得含有R302Q的PRKAG2基因序列,最后通过酶切连接至真核表达载体pIRES2-EGFP中。结果通过RT-PCR获得的人PRKAG2的编码区序列1710 bp,经测序比对与NCBI公布的序列完全一致,通过PCR定点突变拼接900 bp和800 bp片段获得了含有R302Q突变位点的PRKAG2,酶切连接至pIRES2-EGFP载体中,经菌落PCR筛选和酶切验证获得阳性克隆pR302Q-IRES2-EGFP,经测序验证与预期完全一致。结论构建含定点突变人PRKAG2基因重组载体pR302Q-IRES-EGFP为进一步研究基因PRKAG2 R302Q突变体的功能奠定了基础。

PRKAG2基因突变与心脏的关系

PRKAG2基因突变与心脏关系密切,可引起类似肥厚型心肌病表现,如心室预激(WPW综合征)、心肌肥厚、心脏传导功能障碍及糖原沉积,被称为PRKAG2心脏综合征。该病为罕见病,属于常染色体显性遗传性疾病,确诊有赖于基因检测。现就近年来PRKAG2基因的功能研究现状做一综述。

PRKAG2基因G100S新突变对小鼠心肌细胞单磷酸腺苷活化蛋白激酶活性的影响

目的探讨位于非胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase,CBS)区域的PRKAG2基因G100S突变对小鼠心肌细胞单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)活性的影响。方法建立人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,分别随机选取N4代4周龄、12周龄的转基因小鼠和同窝野生型小鼠各6只,用磷酸化检测试剂盒检测小鼠心肌细胞中AMPK活性,比较转基因小鼠与同窝野生型小鼠AMPK活性的差异,并观察随着周龄的增长转基因小鼠AMPK活性的变化。结果 4周龄和12周龄的转基因小鼠心肌细胞中AMPK活性均低于同窝野生型小鼠(0.042±0.013 vs 0.063±0.013,0.032±0.008 vs 0.062±0.018),差异均有统计学意义(P=0.019,P=0.004)。12周龄和4周龄的转基因小鼠心肌细胞中AMPK活性差异无统计学意义(P=0.135)。结论 PRKAG2基因G100S突变可导致转基因小鼠心肌细胞AMPK活性下降,而且AMPK活性并不随着转基因小鼠周龄的增长而变化。

人PRKAG2全长基因的体外拼接及TA克隆载体的构建

目的:应用体外基因拼接及TA克隆技术构建含PRKAG2基因的载体。方法:通过商业途径购得PRKAG2基因的一个转录变体cDNA质粒(GenBank登记号BC068598),其在N端缺失了44个氨基酸,根据已知的PRKAG2基因序列(GenBank登记号NM_016203),设计搭桥引物及序列扩增引物,通过PCR搭桥方法,合成完整全序列的PRKAG2基因,并将其克隆到TA载体,将得到的阳性克隆测序鉴定。结果:拼接出全长1759bp的PRKAG2基因,目的基因连接到载体后测序与设计的PRKAG2基因完全一致。结论:成功的构建了全长人PRKAG2基因的TA克隆,为进一步研究PRKAG2基因的功能提供了模板。

PRKAG2基因R302Q突变致同胞兄弟不同临床表现的研究

目的本研究报道了均携带R302Q突变却具有完全不同临床表现的同胞兄弟二人病例,分析R302Q突变引起PRKAG2心脏综合征的异质性。方法收集临床资料并进行基因测序检测其突变,结合其他家系和实验研究结果进行分析。结果心脏超声示先证者心肌肥厚,其胞弟心超未见明显异常。先证者心电图呈现比较典型的PRKAG2心脏综合征心电图改变如Ⅱ度房室传导阻滞,而胞弟则有偶尔腿部肌肉酸痛和肌型肌酸激酶同功酶(CK-MM)升高表现。结论本研究中兄弟二人截然不同的临床表现显示,即使在同一家系中,R302Q突变引起PRKAG2心脏综合征也具有显著的异质性。

PRKAG2基因新突变体重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达

目的:构建携带人全长PRKAG2基因新突变体(PRKAG2 G100S)及增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)的重组腺病毒载体,并将其在乳鼠心肌细胞中表达。方法:利用Invitrogen的GatewayTM技术,通过重叠PCR技术将目的基因突变体PRKAG2G100S-IRES-EGFP及野生型PRKAG2-IRES-EGFP定向克隆至入门载体pDONR221上,然后与腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST重组反应,形成包含目的基因及EGFP的腺病毒表达克隆。经筛选阳性表达克隆并测序验证后,PacI酶切、包装、扩增、纯化获得携带EGFP及PRKAG2基因的重组体腺病毒。病毒PCR鉴定并将其感染原代培养的SD乳鼠心肌细胞,用Westernblot技术检测PRKAG2蛋白的表达。结果:成功构建了携带人PRKAG2 G100S及EGFP基因的重组腺病毒,病毒的滴度为8.4×108pfu/ml。荧光显微镜下可见Ad-PRKAG2 G100S重组体腺病毒感染后的乳鼠心肌细胞表达EGFP而发出绿色荧光,PCR证实重组腺病毒载体构建成功,Western blot证明PRKAG2蛋白在乳鼠心肌细胞中过表达。结论:成功构建了携带EGFP基因的Ad-PRKAG2 G100S重组腺病毒载体并将其在乳鼠心肌细胞中正确表达,为今后突变体PRKAG2基因的功能研究奠定了基础。

中国人群PRKAG2心脏综合征新突变的PRKAG2基因的功能分析

目的研究中国人群家族性传导系统异常伴心室预激及心肌肥厚患者新错义突变的PRKAG2基因表达和功能变化。方法利用PCR扩增其功能区外显子片段,双脱氧末段终止测序法来构建表达PRKAG2G100S、PRKAG2R302Q及野生型(WT)PRKAG2基因的慢病毒载体,并对其从细胞学水平进行体外实验研究。结果(1)PRKAG2 G100S和PRKAG2 R302Q突变对PRKAG2基因在CCL13细胞中的表达位置没有影响;(2)PRKAG2突变组CCL13/GS和CCL13/RQ与CCL13/WT组相比,PRKAG2蛋白表达量减少,且细胞质及胞核内有较多糖原沉积;(3)PRKAG2基因G100S和R302Q突变降低了CCL13细胞中的AMPK活性,而G100S突变降低AMPK活性的作用弱于R302Q突变(P<0.05或P<0.01)。结论 PRKAG2G100S突变是中国人PRKAG2心脏综合征家系的发病原因,初步证实了突变导致AMPK活性降低及糖原累积是家系的发病机制;G100S突变可能使PRKAG2基因Bateman结构域功能发生变化,但对Bateman结构域功能的影响弱于R302Q突变。

PRKAG2心脏综合征患者心肌肥厚的治疗

目的调查一个存在PRKAG2心脏综合征(一种由编码腺昔酸激活的蛋白激酶γ2亚基的PRKAG2基因突变导致的疾病)的中国汉族5代家系,分析其中伴有心肌肥厚患者的治疗。方法本研究以完全房室传导阻滞伴室间隔非对称性肥厚为主要表现的一个中国汉族5代大家系(n=40)为研究对象,提取可获得的30名家庭成员(6例患者和24例正常人)外周血DNA。应用目的基因捕获结合高通量测序技术对该家系成员进行基因检测。在明确基因诊断后,以室间隔厚度的平均年增加率(以mm/年表示)为指标,对该家系中服用P受体阻滞剂患者的心脏资料进行回顾性分析。结果家系中共6例患者携带PRKAG2基因(c.905G>A;pR302Q)杂合变异。家系患者表型以完全房室传导阻滞伴非对称性室间隔肥厚为主要特征,同质性高,植入心脏永久起搏器后无再发晕厥,但有房扑、房颤的发生。5例患者长期服用B受体阻滞剂,心肌肥厚进展显著延缓。结论当患者出现完全房室传导阻滞伴非对称性室间隔肥厚时,应考虑PRKAG2突变的可能。心脏起搏器的及时植入以及β受体阻滞剂的长期服用可改善预后。