miR-205-5p/PRKCA/p38信号通路在淫羊藿苷抑制动脉粥样硬化中的介导作用

目的探讨miR-205-5p/蛋白激酶Cα(PRKCA)/p38信号通路在淫羊藿苷(ICA)抑制动脉粥样硬化(AS)中的介导作用。方法首先通过整体动物实验研究ICA对载脂蛋白(Apo)E^-/-小鼠的抗AS作用;然后取小鼠胸主动脉组织进行基因芯片检测,再通过生物信息分析找到有意义的miRNA及其作用的靶基因,级联通路;最后应用定量聚合酶链反应(qPCR)及Western印迹方法对所构建的通路在体内外实验标本中进行验证。结果在整体动物实验中,血脂水平和HE染色结果表明,ICA具有抗AS作用;通过对基因芯片检测结果分析找到目标miR-205-5p,通过生物信息分析预测其靶基因为PRKCA,并级联p38信号通路分子,构建miR-205-5p/PRKCA/p38信号通路;qPCR及Western印迹结果显示,在ApoE^-/-小鼠胸主动脉及氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激血管平滑肌细胞(VSMCs)中,模型组miR-205-5p表达显著下降(P<0.001),PRKCA mRNA及蛋白表达显著升高,p38蛋白磷酸化显著增加(P<0.001);ICA干预后,miR-205-5p表达显著升高(P<0.001),PRKCA mRNA及蛋白表达显著下降(P<0.001),p38蛋白磷酸化显著减少(P<0.001),且具有量效关系;ICA对ox-LDL刺激VSMCs的增殖和迁移具有显著抑制作用(P<0.001或P<0.05)。结论ICA具有抗AS作用,其机制可能是通过提高miR-205-5p表达,下调PRKCA mRNA及蛋白表达,进而减少p38蛋白磷酸化,并抑制VSMCs增殖与迁移,从而发挥其抗AS作用。

替莫唑胺通过调控miR-216a/PRKCA抑制胶质瘤细胞U251增殖和侵袭作用的研究

目的:探讨替莫唑胺抑制胶质瘤细胞U251增殖和侵袭的作用,推测其作用机制是通过微小RNA-216a(microRNA-216a,miR-216a)/蛋白激酶Cα(protein kinase C-alpha,PRKCA)进行调控。方法:体外培养胶质瘤细胞U251,用不同剂量替莫唑胺染毒48 h后,构建野生型PRKCA 3'UTR-荧光素酶报告载体及检测荧光素酶活性,检测替莫唑胺对胶质瘤细胞U251增殖和侵袭的影响及miR-216a和PRKCA表达的影响。结果:miR-216a mimics使野生型PRKCA 3'UTR-荧光素酶报告载体的活性下降了47.52%,差异具有统计学意义(P<0.05);miR-216a mimics使突变型PRKCA 3'UTR-荧光素酶报告载体的活性下降不显著,差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组比较,低、中、高剂量组胶质瘤细胞U251增殖率、侵袭细胞数、PRKCA mRNA相对表达量和PRKCA蛋白表达量均降低,miR-216a mRNA相对表达量均增高,差异具有统计学意义(P<0.05);随着替莫唑胺剂量的增加,胶质瘤细胞U251增殖率、侵袭细胞数、PRKCA mRNA相对表达量和PRKCA蛋白表达量随之降低,miR-216a mRNA相对表达量随之增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:替莫唑胺可以通过促进miR-216a的表达而抑制PRKCA的表达,降低胶质瘤细胞U251增殖和侵袭。

樱桃谷鸭PRKCA基因多态性与蛋壳品质的关联性分析

实验旨在探究蛋鸭蛋白激酶Cα(PRKCA)基因多态性与蛋壳品质的关联性,以期找到与蛋壳品质相关的分子标记。利用PCR与直接测序相结合的方法对蛋鸭PRKCA基因外显子区域的SNP突变位点进行检测,并与蛋壳品质性状进行关联性分析。结果显示:在樱桃谷鸭第7外显子区域检测到2个SNP位点g.9583228G>A和g.9583222C>T,均为同义突变且均产生3种基因型。2个SNP位点之间强连锁不平衡,发现3种单倍型和6种双倍型,单倍型H1和双倍型H1H1频率最高;关联性分析结果表明:双倍型H1H3和H2H2个体蛋重显著高于H3H3个体;H2H3、H3H3双倍型个体蛋壳厚度显著高于H2H2个体;H3H3蛋壳强度显著高于H2H2个体。综上,双倍型H3H3是改善樱桃谷鸭蛋壳品质最有利的双倍型,揭示在PRKCA基因外显子7发现的2个SNP位点相互联合能显著影响蛋壳品质,可能作为鸭蛋壳品质选择的遗传标记。

被误诊的乳头状胶质神经元肿瘤一例

乳头状胶质神经元肿瘤(Papillary glioneuronal tumor, PGNT)是一种非常罕见的良性中枢神经系统肿瘤,被归类于胶质神经元肿瘤。临床常表现为顽固性癫痫和头痛,易被误诊为其他疾病。本文现回顾性分析我院收治的1例被外院误诊为脑出血的PGNT患者的诊疗经历、影像学检查及病理学特征来为此类疾病的临床诊治提供参考,旨在提高临床工作者对该病的认识。

风湿性二尖瓣疾病合并心房颤动患者心房纤维化相关微小RNA-647及预测靶基因研究

目的:明确风湿性二尖瓣疾病合并心房颤动(房颤)患者心房组织的主要病理变化,生物信息学分析并筛选与风湿性二尖瓣疾病房颤患者心房纤维化相关的微小RNA(miRNA)及其靶基因。方法:收集在西安交通大学第一附属医院行心脏外科手术治疗的30例风湿性二尖瓣疾病患者(窦性心律组10例,房颤组20例)的临床资料及心房样本。苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫组织化学染色后观察心房组织病理变化;实时定量聚合酶链反应及Western blot法检测纤维化相关蛋白和通路在心房组织中的表达;生物信息学分析并筛选出与风湿性二尖瓣疾病房颤发病机制相关的miR-647及其预测靶基因PRKCA;进一步应用双荧光素酶报告基因确定miR-647的靶基因为PRKCA。结果:相较于窦性心律组患者,房颤组患者左房组织具有典型的心房肌肥大、间质纤维化、心房肌细胞坏死等病理改变;房颤组患者左房纤维化蛋白及通路表达水平显著高于窦性心律组(P均<0.05);生物信息学筛选出风湿性二尖瓣疾病房颤相关miR-647及其纤维化相关的下游靶基因PRKCA;房颤组左房组织中miR-647明显下调,PRKCA表达则明显升高(P均<0.05);双荧光素酶报告基因实验验证miR-647对靶基因PRKCA具有明显的抑制作用(P<0.05)。结论:miR-647靶向作用于PRKCA基因,与风湿性二尖瓣疾病房颤患者的心房纤维化有关。

鹿角方治疗慢性心力衰竭作用机制的网络药理学研究

目的基于入血成分研究鹿角方治疗慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)的机制。方法依托TCMSP数据库和SwissTarget Prediction数据平台预测鹿角方入血成分靶点。运用DisGeNET、TTD、GrugBank疾病数据库挖掘作用于慢性心力衰竭的靶点,将其与鹿角方活性成分靶点相互映射,筛选出共同靶点。应用STRING平台构建靶蛋白相互作用网络,运用Cytoscape软件中的cytoHubba插件分析关键子网络。利用Omicshare平台对筛选出来的靶点进行GO功能富集和KEGG通路分析。结果鹿角方入血成分靶点中与慢性心力衰竭相关的共有37个,它们参与血液循环、血管直径的调节、血压调节、细胞增殖调控等生物过程;调控c GMP-PKG信号通路、钙信号通路、血管平滑肌收缩信号通路、VEGF信号通路、松弛素信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、心肌细胞肾上腺素能信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、TRP通道的炎症介质调节、雌激素、甲状旁腺激素合成、分泌及作用,以及胰岛素抵抗等通路。结论多靶点、多通路调控心血管、抑制炎症、调节激素是鹿角方治疗慢性心力衰竭的主要机理,PRKCA及松弛素信号通路可能是其关键靶点及通路。

miR-216a通过靶向调控蛋白激酶Cα抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭

背景与目的：MicroRNAs是一类19～25bp内源非编码的小分子RNA，其通过靶向抑制基因的转录和翻译水平。本研究旨在明确miR-216a是否通过靶向调控蛋白激酶Ca（PRKCA）表达而抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭能力，从而进一步揭示miR-216a的抑瘤分子机制。方法：首先构建PRKCA3’UTR-荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶报告检测观察miR-216a对PRKCA3’UTR-荧光素酶活性的影响；将miR-216amimics转染胶质瘤细胞U251，采用Westernblot检测PRKCA蛋白表达水平；将PRKCAsiRNA转染U251细胞，通过MTS细胞增殖活性检测和transwell侵袭实验观察PRKCA下调对U251细胞增殖和侵袭的影响。结果：双荧光素酶报告检测显示，miR-216a能特异性地与PRKCAmRNA的3’UTR结合，抑制其荧光素酶活性，下调41％。过表达miR-216a的U251细胞PRKCA蛋白表达水平降低。siRNA干扰PRKCA表达能抑制U251细胞的增殖和侵袭，它能部分模拟miR-216a的抑瘤功能。结论：miR-216a通过靶向PRKCAmRNA3’UTR而抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭。

基于网络药理学研究新“浙八味”衢枳壳黄酮抗肝细胞癌的作用机制

目的 基于网络药理学预测并通过实验验证新“浙八味”衢枳壳黄酮类活性成分抗肝细胞癌的作用机制。方法 通过TCMSP、TCMID、ETCM、BATMAN-TCM及SwissTargetPrediction数据库收集衢枳壳黄酮类化合物(包括柚皮苷、芸香柚皮苷、新橙皮苷)的潜在作用靶点;应用GeneCards、CTD、Disgenet和OMIM数据库构建肝细胞癌疾病靶点集;将衢枳壳黄酮潜在靶点与肝细胞癌靶点取交集以获取关键靶点蛋白,建立蛋白互作网络;对核心靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,并构建成分-靶点-通路-疾病网络;采用增殖、克隆、愈合与迁移试验分析衢枳壳黄酮对肝癌细胞HepG2活力的影响;使用荧光探针染色观察衢枳壳黄酮对HepG2细胞线粒体膜电位与凋亡的影响;运用RT-qPCR技术验证衢枳壳黄酮对网络药理学预测的关键靶点PRKCA的调控作用。结果 基于网络药理学筛选得到217个衢枳壳黄酮的作用靶点,与疾病靶点的交集靶点59个,涉及ALB、ESR1、PRKCA等。GO功能与KEGG通路富集分析显示,衢枳壳黄酮作用靶点共涉及193个生物学过程,13条癌症相关信号通路。实验结果表明衢枳壳黄酮能影响肝癌细胞的增殖、克隆、愈合与迁移能力,导致线粒体膜电位下降并促进细胞凋亡。RT-qPCR的结果表明衢枳壳黄酮能够显著下调PRKCA表达,验证了网络药理学的预测分析结果。结论 本研究揭示了衢枳壳黄酮通过PRKCA靶点治疗肝细胞癌的潜在分子作用机制,为其临床防治肝细胞癌的应用奠定基础。

MiR-296-3p调节多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞凋亡的作用机制

目的:探讨miR-296-3p对多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)大鼠颗粒细胞凋亡的影响。方法:全自动化学发光免疫分析法检测PCOS大鼠血清雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(progesterone,P)、睾酮(testosterone,T)水平;利用苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)检测卵巢病理学改变;TUNEL法检测卵巢细胞凋亡;qPCR检测卵巢miR-296-3p表达水平;将各质粒分别转染卵巢颗粒细胞(ovarian granulosa cells,GCs)后分为miR-NC、miR-296-3p mimic、miR-296-3p inhibitor、miR-296-3p mimic+Vector、miR-296-3p mimic+PRKCA和miR-296-3p mimic+PRKCA+NF-κB组,以未处理的GCs为对照组;Western blot法检测p38、p-p38及NF-κB的表达水平,利用StarBase在线预测和双荧光素酶报告实验验证miR-296-3p与PRKCA的靶向关系,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:与对照组相比,PCOS大鼠卵巢中E2、P、T水平升高,细胞凋亡比例增加,miR-296-3p表达升高;miR-296-3p与PRKCA具有靶向关系,在3'UTR区存在结合位点;与miR-NC组相比,miR-296-3p mimic组PRKCA mRNA表达水平显著下调,p-p38/p38和NF-κB表达上调,miR-296-3p inhibitor组PRKCA mRNA表达水平显著上调,p-p38/p38和NF-κB表达下调;与miR-NC组相比,miR-296-3p mimic组和miR-296-3p mimic+Vector组细胞凋亡比例显著上调;与miR-296-3p mimic组和miR-296-3p mimic+Vector组相比,miR-296-3p mimic+PRKCA组卵巢颗粒细胞凋亡比例显著下调;与miR-296-3p mimic+PRKCA组相比,miR-296-3p mimic+PRKCA+NF-κB组卵巢颗粒细胞凋亡比例显著上调。结论:miR-296-3p通过靶向PRKCA激活p38 MAPK/NF-κB信号通路介导多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞凋亡。

宫颈腺癌与鳞癌组织基因甲基化测定

目的宫颈癌变过程中包括表观基因与调控基因的改变,以DNA甲基化为代表的表观遗传改变可导致宫颈癌的发生。本研究通过分析基因甲基化在早期宫颈腺癌组织中的表达差异性,寻找预测宫颈腺癌发生发展的分子标志物。方法收集新疆医科大学附属肿瘤医院2015-01-01-2017-06-30保存的新鲜初治原发宫颈腺癌组织15例和宫颈鳞状细胞癌组织15例,以及同期住院的正常宫颈组织15例,应用Illumina 850K甲基化芯片筛选宫颈腺癌组织的特异甲基化表达基因,亚硫酸盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)及实时定量RT-PCR(quantitative real time RT-PCR,Q-RT-PCR)方法对宫颈腺癌组织、宫颈鳞状细胞癌组织及正常宫颈组织进行验证。结果芯片筛选结果显示,性别决定区Y框蛋白1(sex determining region Y-box1,SOX1)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)和蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PRKCA)等基因是宫颈腺癌组织中基因调控网络的中心节点。BSP检测结果显示,SOX1基因甲基化程度在宫颈腺癌为(0.975±0.013)%,宫颈鳞癌为(0.871±0.073)%,正常宫颈组织为(0.416±0.256)%,差异有统计学意义,F=18.640,P<0.001。SOX1是宫颈腺癌特异甲基化表达基因。CCND1(F=0.890,P=0.436)和PRKCA(F=1.749,P=0.693)不是宫颈腺癌特异甲基化表达基因,差异均无统计学意义。Q-RT-PCR检测结果发现,SOX1(t=3.213,P=0.009)、PRKCA(t=-3.448,P=0.006)在宫颈腺癌组与宫颈鳞癌组比较差异均有统计学意义。SOX1(t=2.190,P=0.043)、PRKCA(t=-2.561,P=0.028)在宫颈腺癌组与正常宫颈组比较差异均有统计学意义,CCND1在宫颈腺癌组与正常宫颈组(t=3.937,P=0.003)、宫颈鳞癌组与正常宫颈组(t=4.100,P=0.002)差异均有统计学意义。结论抑癌基因SOX1是宫颈腺癌特异甲基化表达基因,有望成为宫颈腺癌诊断的特异标志物。CCND1、PRKCA基因不能证明是宫颈腺癌特异甲基化表达基因,考虑与BSP检测样本量少、检测位点少有关,有待于进一步研究。

基于网络药理学及实验验证探究清热利胆汤治疗胆汁瘀积性肝损伤的作用机制

目的基于网络药理学及实验验证探究清热利胆汤治疗胆汁瘀积性肝损伤的作用机制。方法采用网络药理学方法筛选清热利胆汤和胆汁瘀积性肝损伤相关的核心靶点,构建基于活性成分与疾病共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,利用DAVID数据库对潜在作用靶点进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia ofgenesandgenomes,KEGG)通路富集分析,通过分子对接方法验证活性成分与关键靶点的结合作用。采用胆管结扎方法建立胆汁瘀积性肝损伤大鼠模型,给予思美泰及清热利胆汤进行干预,考察各组大鼠血清中天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)活性以及总胆红素(totalbilirubin,TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)和总胆汁酸(total bile acid,TBA)水平;考察各组大鼠肝组织病理变化;考察各组大鼠肝脏组织蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PRKCA)、原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(protooncogene serine/threonine-protein kinase 1,RAF1)、双特异性丝裂原活化蛋白激酶1(dual specificity mitogen-activated protein kinase 1,MAP2K1)和丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)m RNA表达情况。结果网络药理学分析显示,清热利胆汤可能通过作用于PRKCA、RAF1、MAP2K1和MAPK1靶点,参与MAPK信号通路,从而治疗胆汁瘀积性肝损伤;原花青素B2与MAP2K1、槲皮素与MAPK1具有较好的结合能力。与模型组比较,清热利胆汤组大鼠血清中ALT活性和TBA水平显著降低(P<0.05),肝组织病理损伤得到改善;肝脏组织中PRKCA、MAP2K1和MAPK1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05、0.01),RAF1 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。结论清热利胆汤能够通过调控PRKCA、RAF1、MAP2K1和MAPK1,从而治疗胆汁瘀积性肝损伤。

蛋白激酶C-α基因rs228883多态性与哮喘易感性的关系

目的通过对华东地区哮喘患者和正常人群中蛋白激酶C-α(PRKCA)基因rs228883多态性分布检测,探讨rs228883位点与哮喘易感性的关系。方法对221例哮喘患者和197名的正常对照者,利用Sequenom Iplex系统检测PRKCArs228883位点的多态性后进行统计学分析。结果哮喘与正常组rs228883各基因型的分布差异有统计学意义(P<0.05);在遗传模型上,rs228883更符合超显性模型(P=0.025);与CC+TT相比,rs228883的CT杂合基因型增加了哮喘的发病风险(OR=1.60,95%CI:1.06～2.41,P=0.025)。结论 PRKCA基因多态性位点rs228883可能与哮喘发病相关,杂合基因型CT增加了哮喘发病的危险。