PRKCD预测肺腺癌高度转移有效性及功能研究

目的本研究旨在探讨影响肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)预后和转移的关键基因PRKCD潜在功能和机制作用。方法采用ssGSEA算法量化每个LUAD患者的29个功能性基因表达特征以评价患者的肿瘤微环境景观。LASSO回归分析鉴定预后和转移相关的Treg细胞相关的关键基因。Kaplan-Meier分析构建模型中不同风险组的预后差异。ROC、校准和DCA曲线用来评价构建模型的一致性和准确性。RT-qPCR检测人正常肺上皮细胞和LUAD细胞关键基因的相对表达水平。慢病毒过表达关键基因,Transwell和划痕实验用来检测肿瘤细胞迁移或侵袭能力,Western Blot进一步验证关键基因的功能。结果肿瘤微环境中显示M1期患者共活化因子、B细胞、调节性T细胞以及调节性T细胞和辅助性Th2细胞表现出浸润程度下调(P<0.05)。LASSO回归分析显示PRKCD、BTN2A2、IL2、CTLA4、FANCD2和IRF1被鉴定为预后关键基因,而IL2、PRKCD、TNFSF4、FOXP3、FUT7、BCL6、PSG9、TOX和FANCA被鉴定为转移关键基因(AUC>0.65)。PRKCD和IL2则为转移及预后相关基因。RT-qPCR结果显示PRKCD在肿瘤细胞中低表达。Transwell和伤口愈合实验结果表明,过表达A549和H1975细胞的PRKCD会抑制肿瘤细胞的迁移侵袭。Western Blot结果表明过表达PRKCD可以增强E-cadherin的表达水平,而N-cadherin和Vimentin的蛋白水平则显著被抑制。结论PRKCD可能是LUAD转移及预后的关键基因。PRKCD可通过调控E-cadherin、N-cadherin和Vimentin抑制LUAD转移,为探索LUAD转移提供了新的诊断依据和治疗靶点。

PRKCD和ASK1在人髓系白血病U937细胞分化过程中的作用

目的通过检测ASK1和PRKCD在单核细胞分化过程中的表达变化,探索其在门静脉高压症(PH)脾亢脾脏巨噬细胞(MΦ)功能变化中所起的作用。方法采用佛波酯诱导U937分化成为巨噬细胞样细胞,q-PCR检测不同分化阶段ASK1和PRKCD m RNA的表达,Western Blot检测诱导前后ASK1和PRKCD蛋白表达水平变化,ELISA法检测细胞分化过程中与吞噬功能相关的细胞因子IL-10和TNF-α的分泌情况,鸡红细胞吞噬试验鉴定诱导后细胞功能。结果随着PMA诱导U937细胞时间延长,ASK1和PRKCD基因表达水平下降,TNF-α的分泌量逐渐增加,而IL-10在诱导后24 h达到最大分泌量,随后又呈下降趋势;Western Blot结果显示,ASK1及p-ASK1蛋白表达水平较诱导前均显著上升,PRKCD及p-PRKCD蛋白表达水平显著下降;吞噬实验结果显示,诱导后的细胞具有一定的吞噬功能。结论在PMA诱导的U937细胞向单核细胞分化过程中,ASK1蛋白表达上调,PRKCD蛋白表达下调,与脾亢脾Mφ一致,并导致Mφ活性增强。

高糖应激致人PRKCD基因过表达内皮细胞模型构建及鉴定

目的:构建高糖应激下人PRKCD基因过表达内皮细胞模型并鉴定。方法:设计含AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的PRKCD基因上下游引物,以含PRKCD基因的原始质粒为模版,PCR扩增获得PRKCD全部序列,经AgeⅠ和NheⅠ酶切后与同样酶切后的真核表达载体pDC316-LacZα重组获得穿梭质粒pDC316-PRKCD,经PCR及酶切、基因测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pB-HGlox△E1,3Cre共转染293细胞获得重组腺病毒Ad5-PRKCD,行PCR鉴定并反复纯化扩增后用TCID50法测定病毒滴度。分组培养人脐静脉内皮细胞,转染重组腺病毒后于高糖(25mmol/L)负荷,并设立空载体对照及渗透压对照组,以免疫荧光法检测PKCδ在细胞中的表达。结果:目的基因成功插入穿梭质粒,基因测序结果与GenBank公布序列一致,重组腺病毒Ad5-PRKCD经PCR鉴定及免疫荧光鉴定成功。测得病毒滴度为1.0×1010IU/ml。激光共焦聚观察高糖负荷下,胞内PRKCD翻译产物PKCδ荧光表达强度明显增强,为正常对照组的1.5倍(P<0.05),高糖负荷下内皮细胞感染重组腺病毒后PKCδ荧光强度明显增加,浆/核荧光强度比值较高糖组进一步降低了35%(p<0.05),提示核转位明显。结论:成功构建了人重组腺病毒Ad5-PRKCD并有效转染人脐静脉内皮细胞,高糖负荷使PKCδ表达上调并发生核转位激活,为筛选稳定表达PKCδ的内皮细胞株及其蛋白复合体奠定了基础。

基于生物信息学分析PRKCD在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

目的:基于生物信息学分析蛋白激酶Cδ(PKCδ,PRKCD)在肝细胞癌组织中的表达及临床意义,以期为寻找肝细胞癌的临床诊疗潜在分子标志物和靶点提供参考。方法:利用TheCancerGenome Atlas(TCGA)和UCSCXena平台获取肝细胞癌和癌旁组织中PRKCD的mRNA表达量和临床数据,比较PRKCD mRNA在两组样本中的表达差异;利用HumanProteinAtlas数据库分析PRKCD蛋白在肝细胞癌和癌旁组织中的表达差异;利用TCGA分析PRKCD mRNA表达与肝细胞癌临床病理特征和预后的相关性;利用TCGA数据库对肝细胞癌中PRKCD表达进行GSEA富集分析,并从遗传和表观遗传学的观点分析PRKCD表达变化的原因。结果:PRKCD在肝细胞癌组织中的mRNA和蛋白质水平均显著高于癌旁组织;PRKCD表达与TNM分期、组织学级别、甲胎蛋白含量和患者生存状态相关,并且其表达水平具有一定的临床诊断准确性;Kaplan-Meier分析显示PRKCD低表达患者的预后显著优于高表达患者;单因素和多因素Cox回归分析显示,PRKCD是肝细胞癌患者独立预后因素,且TNM为Ⅲ和Ⅳ期生存曲线的风险比显著大于Ⅰ和Ⅱ期;GSEA分析显示PRKCD主要富集在细胞周期和DNA复制等过程,并与两者呈正相关性,且PRKCD主要参与了趋化因子、NOD样受体、PPAR、脂肪细胞因子和T细胞受体信号通路;遗传和表观遗传分析显示PRKCD表达水平与其基因的拷贝数呈正相关,但与其甲基化水平呈负相关。结论:PRKCD基因在肝细胞癌组织中表达上调,且其表达上调与患者预后不良具有显著相关性。

Expression and clinical significance of PRKCD in liver hepatocellular carcinoma analyzed based on bioinformatics

Objective:To analyze the expression of protein kinase C delta(PKCδ,PRKCD)in Liver hepatocellular carcinoma and its clinical significance based on bioinformatics,in order to provide a new direction for the study of therapeutic targets for Liver hepatocellular carcinoma.Methods:The PRKCD gene expression data and patient clinical information data in Liver hepatocellular carcinoma tissues and adjacent tissues were downloaded from The TCGA(The Cancer Genome Atlas)and UCSC Xena databases.The mRNA expression of PRKCD in Liver hepatocellular carcinoma was analyzed,and the protein expression of PRKCD in Liver hepatocellular carcinoma was analyzed by Human Protein Atlas(HPA)databases.Furthermore,its relationship with clinicopathological features and prognosis in patients with Liver hepatocellular carcinoma was analyzed.GSEA enrichment analysis were carried out for PRKCD in Liver hepatocellular carcinoma.Finally,the causes of changes in PRKCD expression were analyzed from the perspective of genetic and epigenetics based on collated liver hepatocellular carcinoma data.Results:Both the mRNA and protein expression level of PRKCD gene in Liver hepatocellular carcinoma tissues was significantly higher than that in adjacent tissues.Its expression level was correlated with TNM stage,Histologic grade,Alpha fetoprotein(AFP)and Living status in clinicopathological features,and its expression level has certain clinical diagnostic accuracy.Kaplan-Meier analysis showed that the prognosis of patients with low PRKCD expression was significantly better than that with high PRKCD expression.Univariate and multivariate Cox regression analysis showed that PRKCD was an independent prognostic factor in patients with Liver hepatocellular carcinoma,and it was also found that the risk ratio of TNM stage III and stage IV survival curve(HR)was significantly greater than that of stage I and stage II.GSEA analysis showed that it was enriched in cell cycles and DNA replication,and was positively correlated with PRKCD.Enrichment analysis found that PRKCD is mainly involved in the chemokine signaling pathway,NOD-like receptor signaling pathway,PPAR signaling pathway,adipocytokine signaling pathway and T-cell receptor signaling pathway.Finally,through genetic and epigenetic analysis,it is found that the increase in the number of copies of genes will increase the expression level of PRKCD,and the methylation level is negatively correlated with the expression level of PRKCD.Conclusion:PRKCD gene is upregulated in Liver hepatocellular carcinoma tissues,and its overexpression level is closely related to patient poor prognosis.

miR-181a调控结肠癌细胞生长的作用和机制研究

结肠癌是指结肠黏膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变，是常见的恶性肿瘤之一，占所有恶性肿瘤的10％～15％^[1]。结肠癌的发病原因与遗传、结肠腺瘤、息肉病、慢性炎症、高脂肪、少纤维饮食习惯等都有一定关系^[2]，结肠癌发病隐匿，病程慢早期无明显的临床表现，出现明显症状时大多已到了中晚期，病死率仅次于肺癌和肝癌，是危害人们健康的可怕杀手^[3]。

miR-181a在卵巢癌细胞中对顺铂的耐药作用

目的探讨miR-181a在卵巢癌化疗抵抗方面的影响及其机制。方法qRT-PCR检测卵巢癌细胞A2780及A2780/DDP中miR-181a的表达;对A2780及A2780/DDP细胞分别进行miR-181a mimics和inhibitors的转染,并利用qRT-PCR技术验证;MTT法检测转染前后细胞对顺铂的敏感性,利用TargetScan、miRDB与miRwalk 3个MicroRNA靶基因数据库预测miR-181a下游靶点,并通过Western blot技术分析预测基因的表达。结果与A2780细胞相比,miR-181a在A2780/DDP细胞中的表达明显减弱(P<0.05)。干扰miR-181a表达后,A2780细胞对顺铂的抵抗作用减弱(P<0.05),而上调miR-181a表达,A2780/DDP细胞对顺铂的抵抗作用增强(P<0.05)。通过TargetScan、miRDB、miRwalk三个数据库预测到PRKCD可作为miR-181a下游靶基因,下调miR-181a表达可使PRKCD蛋白表达明显增强(P<0.05);反之,上调miR-181a表达能够显著抑制PRKCD蛋白表达(P<0.05)。结论miR-181a卵巢癌细胞对顺铂的耐药性方面具有抑制作用。

DCP1A与肝细胞癌预后的相关性研究

目的通过癌症基因图谱(TCGA)数据库分析增强子RNA(eRNA)DCP1A及其靶基因PRKCD表达与肝细胞癌(HCC)患者预后的相关性,为DCP1A作为新的HCC治疗靶点提供科学依据。方法下载使用PreSTIGE算法鉴定出的eRNAs及其靶基因列表。提取TCGA数据库中33种癌症的基因表达矩阵及对应的临床数据。通过R语言对eRNA与HCC患者的预后进行生存分析筛选出目标eRNA及其靶基因,对目标eRNA及其靶基因结合临床信息进行差异分析、Cox多因素分析、联合效应分析、GO功能注释、KEGG富集分析,并验证目标eRNA在其他32种肿瘤中与预后的关系。结果DCP1A为与HCC预后相关性最强的eRNA,DCP1A及PRKCD表达在HCC患者中呈现正相关(r=0.524,P<0.001)。生存分析显示DCP1A及PRKCD低表达组患者预后均优于两者高表达组患者(P<0.001,P=0.005)。DCP1A及PRKCD在HCC组织中表达均高于正常组织,差异均有统计学意义(P均<0.001)。DCP1A及PRKCD高表达预示着更高TNM分期。Cox多因素结果显示,DCP1A及PRKCD表达为HCC患者独立预后因素(P=0.003,P=0.043),DCP1A表达高低与肾透明细胞癌、直肠腺癌、胸腺瘤的预后相关(P=0.004,P=0.001,P=0.042)。结论eRNA DCP1A及其靶基因PRKCD的表达差异可能与HCC的发病及预后显著相关,可以利用其作为肿瘤发生和治疗效果评价的指标,其还可作为新的肿瘤治疗靶点。