利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系

蛋白激酶D1 (protein kinase D1, PKD1;也称作PRKD1)是蛋白激酶家族成员之一,该家族由3种结构相关的应激激活酶组成,可调节机体多种生物学功能,主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节、心脏收缩、血管生成和癌症等,其中PRKD1与心脏肥大、收缩和缺血再灌注损伤的底物磷酸化有关。相关研究报道,先天性心脏病患者存在PRKD1基因突变,但其在心脏中的特异性功能和分子机制并未阐明。为了便于后期研究PRKD1基因在人类早期心脏发育的作用机制,本文拟利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系。首先,通过生物信息学网站筛选出两个最佳的基因敲除靶位点,合成相应靶位点的单链向导RNA (single guide RNA,sg RNA)和引物;然后,将两个靶位点的sg RNA进行体外转录,并将其与Cas9蛋白混合后共同注射到斑马鱼的1-细胞期;最后,对基因敲除后的F0、F1、F2及F3代斑马鱼的胚胎和成鱼进行有效性鉴定及表型观察。结果显示,靶位点附近出现了不同程度的碱基缺失;成功构建了F1代能够稳定遗传的prkd1基因敲除的3个亚系;与野生型相比, F3代纯合子胚胎表现出不同程度的心腔膨大、环化异常及心管线性化等畸形现象。综上可知,本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼prkd1基因敲除品系,为进一步研究该基因在人类心脏发育中的特异性功能提供了有益参考,并为后期的先天性心脏病筛查和精准医疗提供了重要依据。

斑马鱼prkd1基因在心脏早期发育过程中的作用研究

为了探究蛋白激酶D(protein kinase D,PKD;又名PRKD)家族典型成员prkd1基因对早期心脏发育的影响,选用模式动物斑马鱼为研究对象,设计了吗啉代反义寡核苷酸敲低实验。表型观察结果显示,prkd1基因敲低会导致斑马鱼心脏发育异常,出现心包水肿、环化异常、心管线性化等畸形表型;斑马鱼心率分析数据显示,与野生型斑马鱼相比,prkd1基因的敲低会导致早期斑马鱼心率降低。利用转录组高通量测序技术对受精后3 d(3 days post fertilization,3 dpf)的斑马鱼对照组和敲低prkd1组进行测序,差异基因富集分析表明,prkd1的敲低与心脏相关信号通路如心肌细胞的肾上腺素信号通路等显著相关。进一步通过qRT-PCR对高通量测序结果进行验证,并对早期心脏发育关键因子进行检测,结果显示,部分心血管相关基因显著下调,tbx5a、gata4等心脏调控关键基因同样显著下调。这些表明prkd1基因可能通过调控心脏发育相关信号通路以及心脏发育关键基因来影响早期心脏发育,在早期心脏发育过程中发挥重要作用。

2型糖尿病患者外周血单个核细胞中miR-375的表达及调控研究

目的探讨2型糖尿病患者外周血单个核细胞中miR-375的相对表达,进一步探讨其潜在的调控机制。方法收集我院2015-2016年20例初诊的2型糖尿病患者及20例健康对照者外周抗凝全血,运用Ficoll法分离外周血单个核细胞;运用实时荧光定量PCR检测基因的相对表达量;运用生物学信息软件targetscan7.0预测miR-375调控的靶基因;采用常规法培养细胞;并构建双荧光报告基因载体验证miR-375与靶基因的结合作用。结果PRKD1是miR-375调控的靶基因之一,miR-375在2型糖尿病患者外周血单个核细胞中呈高表达,而PRKD1呈低表达,两者的相对表达量具有负相关性。共转染WT-PRKD1-3’UTR表达载体与miR-375mimics至HT29细胞,荧光活性明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05),转染mut-PRKD1-3’UTR表达载体与miR-375mimics至HT29细胞,荧光活性无显著改变(P>0.05);抑制miR-375的表达,促进PRKD1的表达。结论2型糖尿病患者外周血单个核细胞中miR-375的表达显著升高,PRKD1是其潜在的靶基因。这为揭示2型糖尿病的发病机制提供了线索。