肌苷合成关键酶活性与肌苷积累之间的关系

测定比较了高产肌苷菌、低产肌苷菌和野生菌肌苷合成途径中PRPP转酰胺酶、sAMP合成酶、IMP脱氢酶和 5′ 核苷酸酶的比活以及活细胞的肌苷水解能力 ,进一步阐明了菌株产苷性能与肌苷合成途径关键酶活力间的密切关系。根据高产肌苷菌的酶学特性 ,确定了高产肌苷菌进一步基因工程改造的方向。研究表明酶学研究对有目的、有方向地进行高产菌株的选育工作具有重要意义。

利巴韦林发酵过程中腺嘌呤限量供应的初步研究

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）TA208-LM是腺嘌呤缺陷型突变株,腺嘌呤浓度过低会影响菌体生长,过高又会反馈阻遏关键酶的合成。首先对腺嘌呤供体的种类和用量进行了研究,摇瓶发酵结果表明Springer 2506是最佳的腺嘌呤供体,用量在15 g/L时最有利于利巴韦林积累,但发酵后期腺嘌呤浓度过高。因此在降低Springer 2506的初始浓度的基础上,额外添加腺嘌呤,结果发现初始腺嘌呤总量为47.95 mg/L时,发酵液中腺嘌呤含量维持在40~50 mg/L,PRPP转酰胺酶活力最高,合成利巴韦林的量最大。实验表明,控制腺嘌呤供体酵母抽提物的初始用量,在发酵过程中流加酵母抽提物可能是维持适宜腺嘌呤浓度的有效手段。在7.5 L发酵罐上对Springer 2506分批补料发酵方式进行研究,结果发现以7.5 g/L Springer 2506为底物,流加7.5 g/L的Springer 2506,比一次性添加15 g/L的Springer 2506,利巴韦林的积累量提高11.29%。

解淀粉芽胞杆菌关键酶基因过表达对鸟苷积累的影响

【目的】研究鸟苷生物合成途径中的3个关键酶编码基因(prs,purF,guaB)过表达对解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)发酵生产鸟苷的影响。【方法】利用穿梭表达载体PBE43,构建含有prs、purF和guaB基因的单独表达载体和prs、purF基因的串联表达载体,将它们分别转入鸟苷生产菌B.amyloliquefaciens TA208后,通过实时定量PCR测定各工程菌株内相关基因的转录水平;通过酶活检测分析关键酶基因扩增对肌苷酸脱氢酶活性的影响;通过摇瓶发酵实验考察工程菌株与对照菌株的生长、耗糖和鸟苷积累情况。【结果】转录分析结果表明prs、purF和guaB基因过表达的同时都伴随着自身转录水平的显著上调。与此同时,prs和purF基因单独表达均轻微下调了嘌呤操纵子的转录水平,但是guaB基因的过表达并不影响嘌呤操纵子和prs基因的转录。酶活分析结果表明prs和purF基因扩增并不影响肌苷酸脱氢酶的活性,guaB基因的扩增使其活性提高了126%。摇瓶发酵实验发现prs和purF基因的单独过表达均未促进宿主菌合成鸟苷,而含guaB基因过表达载体的工程菌鸟苷产量较出发菌株提高20.7%。将prs和purF基因串联表达后,鸟苷产量提高14.4%,糖苷转化率增加6.8%。【结论】过表达guaB基因能够大幅提高鸟苷产量,而prs和purF基因只有实现协同表达才能对宿主菌积累鸟苷产生积极影响,为通过代谢工程技术提高鸟苷产量奠定了研究基础。

枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的修饰对腺苷积累的影响

【目的】研究嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因的共同过表达对枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响。【方法】利用温敏质粒pKS1,以单交换的形式增加了purF基因在基因组上的拷贝数,同时将强启动子P43插入嘌呤操纵子中,使嘌呤合成途径中purF基因及其下游purM、purN、purH和purD基因的表达水平得到加强,通过实时定量PCR(Realtime Quantitative PCR,RT-qPCR)测定相关基因(purF、purM、purN、purH和purD)的转录水平;通过酶活性检测分析关键酶基因扩增对PRPP转酰胺酶活性的影响;通过发酵实验考察出发菌株与工程菌株的生长、耗糖和腺苷积累情况。【结果】实时定量PCR结果表明,purF、purM、purN、purH和purD基因的表达水平均有不同程度的提高,嘌呤合成途径中关键酶PRPP转酰胺酶的活性是出发菌株的2.4倍。摇瓶发酵实验发现工程菌腺苷产量较出发菌提高17.5%,糖苷转化率增加26.1%。5 L罐发酵实验表明,虽然工程菌的菌体生长受到一定的影响,但在相同发酵周期内腺苷产量比出发菌提高了9.7%。【结论】嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因转录水平的增强能够提高腺苷的产量,为通过代谢工程技术改造腺苷生产菌提供了理论依据和研究思路。