PRRSV Nsp4基因突变株对β2M表达的影响

[目的]本试验旨在探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp4基因是否在抑制细胞β2M表达方面发挥关键性作用,以进一步研究PRRSV对抗原递呈的免疫抑制机制。[方法]建立PRRSV的反向遗传平台并成功拯救出PRRSV野生毒株SH2020。根据之前对Nsp4基因不同结构域的研究以及氨基酸位点功能预测,在其DomainⅡ和DomainⅢ分别筛选出3个和5个不同的氨基酸位点,并在病毒感染性克隆质粒上对这些位点进行不同的氨基酸替换突变,再将构建好的感染性克隆质粒转染Marc-145细胞以拯救各个Nsp4突变PRRSV病毒,将拯救的PRRSV病毒以MOI=0.02感染PAM细胞,并通过RT-qPCR和Western blot验证PRRSV Nsp4基因是否能够在PAM细胞β2M表达方面发挥作用。[结果]成功拯救出PRRSV D2-5(Nsp4-A80L)突变毒株,并且在Marc-145细胞上的生长动力学特性与野生毒株SH2020相似;而Nsp4基因其余位点突变则会导致PRRSV生长受到显著抑制从而无法进行试验。Western blot和RT-qPCR试验结果证实PRRSV D2-5毒株能够显著促进β2M在Marc-145和PAM细胞的表达,而野生毒株SH2020则表现出了对β2M表达的抑制作用。[结论]Nsp4基因在PRRSV抑制细胞β2M表达方面发挥重要作用,并且Nsp4-A80L突变能够显著促进β2M的表达。

2021—2023年湖南省无害化处理场CSFV、PRV、PRRSV污染情况调查

为了解湖南省2021—2023年无害化处理场猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)污染情况,采用RT-qPCR方法对采集的1825份淋巴结、脾脏、耳尖等组织样品进行CSFV、PRV、PRRSV核酸检测,并对2022年衡南县PRRSV阳性样品进行分型检测及Nsp2基因测序。结果显示:CSFV、PRV、PRRSV的阳性检出率分别为3.01%、1.81%、30.14%;双重污染率为2.52%,以PRRSV与其他2种病原双重污染为主,三重污染率较低,为0.05%。2022年衡南县无害化处理场的PRRSV阳性检出率为24.12%,以春、冬季阳性率较高;北美型(NA-PRRSV)、高致病型(HP-PRRSV)、类NADC30毒株(NADC30-like)阳性检出率分别为98.39%、20.97%、43.55%;经Nsp2基因测序,1条序列存在“1+29”个不连续氨基酸缺失,为HP-PRRSV毒株,17条序列存在“111+1+19”个不连续氨基酸缺失,为类NADC30毒株。结果表明:2021—2023年,湖南省无害化处理场CSFV、PRV污染率维持在较低水平,PRRSV污染率较高,呈逐年上升趋势,其中类NADC30毒株为优势流行毒株,建议持续做好猪瘟及猪伪狂犬病的免疫接种及效果评估工作,加强PRRSV的遗传变异监测及养殖场的饲养管理和生物安全管理,以保障猪群生产安全。

中药添加剂抗PRRSV作用机制研究与应用进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)在全球范围内造成重大经济损失,对生猪养殖业构成严重威胁。接种灭活疫苗或弱毒疫苗是预防PRRS的主要措施,但由于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)存在高变异性,目前的疫苗已不能有效防控PRRSV的感染,而采用西药预防和治疗易产生耐药性,对动物机体危害极大,在生猪养殖生产中的应用受到了限制,因此迫切需要探索新的抗病毒措施。中药具有来源广、成本低、毒副作用小等优点;同时,中药活性成分多,具有抗病毒、抗氧化和提高免疫力等功能,在疾病防控中应用历史悠久。但中药成分复杂,具体抗病毒机制尚不明确。文章从中药的有效成分、抗病毒主要作用机制以及在抗PRRSV中的应用等几个方面对中药抗PRRSV的研究进行了综述,以期为中药在生猪生产中用以防控PRRSV提供参考。

2020—2022年闽粤赣地区PRRSV ORF5基因的分子流行病学调查

【目的】了解闽粤赣地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子流行动态,为该疫病的科学防控提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对2020—2022年闽粤赣地区1475份临床猪组织和血清样品进行检测,对PRRSV阳性样品进行ORF5基因扩增和测序,并对ORF5基因的序列进行系统发育分析。【结果】2020、2021、2022年闽粤赣地区发病猪PRRSV的阳性率分别为24.23%(95/392)、27.69%(162/585)、18.07%(90/498),2020—2022年福建、广东、江西地区PRRSV的阳性率分别为23.20%(272/1172)、23.96%(52/217)、26.44%(23/87)。挑选来自不同猪场的86份阳性样品进行PCR扩增,成功获得62株PRRSV ORF5基因序列,并下载GenBank已发布的18株2020—2022年闽粤赣地区PRRSV的ORF5基因序列,与127株PRRSV国内外参考株ORF5基因序列构建系统发育树。系统发育树显示,80株闽粤赣PRRSV分离株均属美洲株。其中,40株分布在谱系1(NADC30-like株、NADC34-like株)上,12株分布在谱系3(GM2-like株、QYYZ-like株)上,7株分布在谱系5(VR2332-like株、BJ-4-like株)上,21株分布在谱系8(JXA1-like株、CH-1a-like株)上。对核苷酸和氨基酸序列的同源性进行分析,结果显示,80株PRRSV ORF5基因编码的核苷酸序列同源性为81.2%~100%,氨基酸序列同源性为78.6%~100%。33株PRRSV ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列在中和表位区第39氨基酸残基处存在变异。【结论】2020—2022年闽粤赣地区PRRSV流行株以谱系1为主(50.00%),并存在谱系1、3、5、8的混合流行。

PRRSV、CSFV、PRV和PCV2四重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Man探针,并进行反应体系优化,敏感性、特异性验证,建立了同时检测上述4种病原的四重实时荧光定量PCR。结果显示,所建立的四重荧光PCR扩增效率(E)、相关系数(R^(2))及曲线斜率均在正常范围内,检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2 E值、R^(2)、斜率分别为92.9%、0.998、-3.504,90.7%、0.998、-3.566,94.3%、0.996、-3.466,94.2%、0.997及-3.470。PRRSV、CSFV、PRV、PCV2重组质粒最低检出限分别达到10^(2)、10^(2)、10^(2)、10^(3) copies/μL;四重qPCR反应体系中的多条引物间不发生交叉反应,经评价该方法特异性良好;批内和批间重复性试验结果显示,变异系数(CV)均在1%以下,具有良好的重复性。分别使用该方法和相应的国标荧光定量检测法对采集的298份临床样品进行检测对比,两种方法检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2阳性符合率分别为96.08%、96.38%、100%、94.95%,均在94%以上。结果表明,建立的检测方法方便、灵敏、高效、特异性强,适用于猪呼吸道疾病病原学、流行病学研究以及临床病例的诊断,并为猪呼吸道疾病的预防和控制提供技术支撑。

丁壮素酸乳对PEDV和PRRSV体外增殖的影响

为探究丁壮素酸乳对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)体外增殖影响,本研究使用CCK-8法分别检测丁壮素酸乳对Vero细胞和Marc-145细胞的毒性,采用实时荧光定量PCR分别检测PEDV、PRRSV在不同质量浓度丁壮素酸乳作用下的基因组拷贝数。实验结果显示:100~500μg/mL丁壮素酸乳对Vero细胞和Marc-145细胞活性没有显著影响;200~300μg/mL丁壮素酸乳显著抑制PEDV增殖,100~300μg/mL丁壮素酸乳显著抑制PRRSV增殖。实验结果表明,200~300μg/mL丁壮素酸乳对PEDV和PRRSV的体外增殖具有显著的抑制作用,且无细胞毒性。

2013—2021年云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行与混合感染状况调查

【目的】调查云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的流行规律和混合感染情况。【方法】采用分子生物学方法对2013—2021年间的3112份血液样品进行PRRSV核酸检测,并进一步分析其流行和混合感染情况。【结果】检测样品中,有801份样品为PPRSV阳性,阳性率为25.74%,二重、三重和四重混合感染率分别为41.20%、12.48%和1.87%;不同生长阶段猪群的PRRSV感染程度差异较大,生长育肥猪感染最严重(33.24%);相对于育肥场和散养户,种猪场的感染程度较轻,三者的感染率分别为27.94%、28.94%和14.29%。对不同毒株类型分析发现:高致病性毒株和经典毒株仍是主要的流行毒株,分别占毒株数的58.49%和22.64%,但占比呈逐年下降趋势。于2019年和2021年在云南省内分别发现了类NADC30毒株和类NADC34毒株,分别占毒株数的15.09%和3.77%,其感染率呈逐渐上升趋势。【结论】猪繁殖与呼吸综合征仍是影响云南省生猪产业健康发展最重要的疫病之一,表现形式以和其他疾病混合感染为主。随着新毒株的发现,云南省PRRSV基因更加多样,防控形势愈加复杂。

脂质代谢和糖代谢在PRRSV感染宿主细胞中作用研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染可引起母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道疾病及公猪精液质量下降,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV不能自主复制,其生命周期的各个阶段均依赖于宿主的代谢系统。宿主细胞也可调节其代谢过程,以防止PRRSV复制和维持其正常生理功能。脂质代谢和糖代谢在PRRSV感染中均扮演了重要角色,PRRSV作为一种囊膜病毒对脂质代谢系统的依赖性较其他代谢系统更强。脂质参与了PRRSV生命周期的各个阶段,包括吸附、进入、复制、组装和释放,此外还与细胞炎症、免疫和凋亡有关。糖代谢也可干扰PRRSV的生命活动,从而促进或抑制PRRSV复制。文章综述了脂质代谢中脂肪酸、胆固醇、磷脂、脂滴和脂筏以及糖代谢中糖酵解和三羧酸循环在PRRSV感染宿主细胞中的作用,以期为阐明PRRSV的致病机制以及疫苗和抗PRRSV药物的研发提供基本理论依据。

Pig Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Does Not Attach to Boar Sperm;It Affects Only the Velocity Pattern and the Mobility Pattern

The purpose of the study was to evaluate the sperm viability of semen infected with PRRSV viral particles, observing the effect of the Virus on the motility of boar sperm. The work was carried out at the FMVZ-BUAP Genetics and Reproduction Laboratory. 5 stallions were used. Each sample contained 1 × 106 sperm, the PRRS virus strain was ATCC-VR-2332 (0, 102, 104 and 106 copies of RNA/mL in triplicate), it was observed daily at the CASA;Hamilton Thorne®. Cells with MT (P < 0.05) on days 1, 3, 5, 7 and 10 of evaluation with 201 ± 7.3, 167 ± 10.1, 165 ± 14.6, 134 ± 8.2 and 120 ± 8.8, respectively. The % MP between control and virus concentrations (P ≥ 0.05). The LCV on day 1 and 7 PI at 10X2 and 10X6 (P < 0.05) vs control. In the Correlation Matrix, where it is observed that there is a correlation between VSL and VAP, VSL and VCL, VCL and ALH, VAP with ALH. There is a correlation of VSL and ALH, STR and ALH. In this study there were (P ≤ 0.01) in the VCL, in the concentrations (102) 162.81 ± 10.65 and (106) 177.12 ± 5.77 vs 193.04 ± 4.62 of control. This indicates that altering these parameters would be related to fertility and the PRRS virus affects the LCV. Regarding the VSL, it was observed that the sperm infected with viruses 102, 104 and 106 of 48.00 ± 3.38, 49.88 ± 1.83 and 50.55 ± 2.24 Vs. 56.66 ± 1.68 of control respectively, the control would have greater possibilities of fertilizing the oocyte. In this study, it was found (P ≤ 0.01) in the VAP with 102 of 77.26 ± 5.16, 104 with 83.35 ± 2.41 and 106 with 81.29 ± 3.14 vs the control with 90.56 ± 2.07. Regarding the ALH there is (P < 0.05) a 104 with 8.70 ± .26 and 106 with 9.64 ± 0.23 vs control 8.50 ± 0.27. The presence of different concentrations of PRRSV in boar semen induces changes in different types of sperm motility. Infection of ejaculates with the PRRS virus affects sperm motility on days 1, 3, 5, 7, and 10 post-infections.

规模化猪场PRRSV不同感染状态下防控实践探讨

本文针对猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)不同感染状态,通过不同防控措施(接种疫苗、药物保健和生产组织优化),探讨了猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的防控经验。试验结果:PRRSV阳性不稳定猪群,接种PRRS灭活疫苗连续2次,1个月可实现猪群抗原阴性,阴性维持时间大约100d;PRRSV阴性猪群采用PRRS弱毒活疫苗半数低剂量免疫,排毒时间约28 d,免疫猪群100%转阳,而未免疫猪转阳率为30%~40%。

中国新发L1A PRRSV变异株的出现与流行状况分析

2017年我国首次发现类NADC34 PRRSV,该类病毒属于L1A(Sublineage1.5)亚型。近年来,新发类NADC34 PRRSV在我国不断变异,已经成为危害我国养猪业重要的PRRSV亚型。为了确定新发类NADC34 PRRSV的流行特征,本研究从2021年~2023年37份新发类NADC34 PRRSV阳性病料样品中选择4份样品经PCR分段扩增PRRSV全基因组序列并测序,利用SeqMan软件拼接,获得了4株完整的PRRSV全基因组序列,相应的病毒分别命名为TZJ2165、TZJ2451、TZJ2756、WK621株。下载GenBank中所有中国类NADC34 PRRSV和美国L1C变异株的ORF5基因及NSP2基因序列,利用MEGA7.0构建上述PRRSV ORF5基因序列的遗传进化树,分析其遗传变异情况。利用Megalign软件分析各分支内ORF5基因序列的相似性,以及新发类NADC34 PRRSV NSP2氨基酸序列,分析其是否存在一致的氨基酸缺失特征。根据PRRSV ORF5基因的限制性片段多态性(RFLP)分类方法,对新发类NADC34 PRRSV的ORF5基因序列分类。利用Simplot软件分析新发类NADC34 PRRSV和L1C变异株全基因组序列中的重组事件。基于ORF5基因进化树结果显示,这4株新发类NADC34 PRRSV与之前分离的TZJ2007、BJ-20-06等12株PRRSV均属于L1A亚型,与早期类NADC34 PRRSV相比,这些病毒株形成了一个独立分支,将其命名为L1A变异株,且其ORF5基因序列的相似性≥93%。NSP2氨基酸序列比对分析发现,L1A变异株具有一致的131个氨基酸不连续缺失的分子特征。ORF5基因的RFLP模式分析结果显示,L1A变异株RFLP模式分为1-4-2、1-4-4、1-5-4、1-7-4和1-6-4,模式并不一致。重组分析结果显示,L1A变异株存在相似的重组模式,它们均是以NADC30株(类NADC30 PRRSV)为主要亲本,JXA1株(类HP-PRRSV)提供部分非结构蛋白基因区域、IA/2014/NADC34株(类NADC34 PRRSV)提供ORF2a~ORF6区域的重组病毒。目前L1A变异株已经在黑龙江、内蒙古、辽宁、北京、广西、江苏、四川、福建、山东、广东和山西等11个省份检出。通过与美国L1C变异株比较,发现二者流行特征有诸多相似性,鉴于L1C变异株对美国养猪业造成严重影响,加大对L1A变异株的监测力度至关重要。本研究聚焦新发类NADC34 PRRSV的流行及变化特征,对了解我国PRRSV流行现状以及对PRRS的防控均具有重要的指导意义。

2022年浙江省PRRSV流行毒株ORF5基因序列遗传进化分析

为了解2022年浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的基因型及变异情况,采用RT-PCR方法,对浙江省不同地区收集的37份PRRSV阳性病料组织进行ORF5基因扩增,应用DNAstar和Mega7软件进行同源性和遗传变异分析。结果显示:37份阳性样品的ORF5基因核苷酸和编码氨基酸之间的同源性分别为82.1%~100%和81.1%~100%;阳性样品的ORF5基因与高致病性PRRSV毒株JXA1、经典PRRSV毒株VR2332、国内早期PRRSV毒株CH1-a、NADC30类毒株、NADC34类毒株和新型PRRSV毒株QYYZ的核苷酸同源性分别为84.1%~98.7%、83.9%~99.7%、85.2%~95.0%、85.3%~94.0%、86.4%~96.2%和82.8%~85.1%,编码氨基酸同源性分别为83.6%~99.5%、82.6%~99.0%、84.1%~93.5%、83.1%~94.5%、85.6%~95.5%和81.1%~86.6%。37份阳性样品的感染毒株均为美洲型,分属于1、5、8等3个谱系,其中谱系1(NADC30类和NADC34类)占比最高(23/37),有6份阳性样品的感染毒株具有强毒株特性。与参考毒株相比,37份阳性样品的GP5蛋白氨基酸变异主要集中于信号肽、2个高变区、B细胞抗原位点和2个T细胞抗原位点附近;与疫苗株相比,中和抗原表位存在氨基酸突变。结果表明:浙江省存在多个谱系美洲型PRRSV毒株流行,其中谱系1为优势流行毒株,部分毒株具有高致病性;不同毒株间存在一定的基因变异,与疫苗株相比流行毒株也出现了变异。因此,需要继续加强PRRSV监测,及时掌握PRRSV流行毒株的遗传变异状况,以便为PRRS防控提供参考。

我国PRRSV流行情况及防控策略

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)已在中国流行近30年,当前仍是严重危害我国养猪业的头号疫病。目前,美洲型NADC30-样毒株已成为国内的优势流行毒株,并与经典毒株、高致病性毒株、最新发现的NADC34-样毒株及各种变异和重组毒株共存。当前广泛使用的PRRS商品疫苗不能提供令人满意的防控效果。为了有效防控PRRS,在加强饲养管理和强化生物安全控制的同时,新型疫苗研制或新型抗病毒药物开发也迫在眉睫。总之,本文系统阐述了我国的PRRS流行情况及防控策略,以期为控制PRRS提供指导。

PAMs免疫粘附受体CR 1-like对PRRSV感染的影响

[目的]本试验旨在探讨猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)表面天然免疫粘附受体—猪I型补体受体(Porcine complement receptor 1⁃like,CR1⁃like)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respi⁃ratory syndrome virus,PRRSV)感染PAMs的影响,为阐述CR1⁃like在PRRSV免疫应答中的生物学功能提供理论数据。[方法]采取PRRSV减毒活疫苗免疫接种PRRSV抗体为阴性的长白仔猪20~28 d后,提取分离抗病毒血清并检测抗PRRSV血清中和效价;将抗PRRSV血清进行不同倍比稀释,制备各类PRRSV抗原抗体复合物并接种于PAMs上,建立抗体依赖性增强(Antibody⁃dependent enhancement,ADE)模型,qRT⁃PCR技术检测各时间点PRRSV N基因拷贝数变化;PRRSV感染PAMs 9 h后,将抗血清和猪新鲜血清共处理细胞,运用ELISA测定不同时间点细胞上清液中猪新鲜血清C3b、C4b、CH50总活性;将PAMs分为试验组(PRRSV感染PAMs 9 h后同时加入抗血清和猪新鲜血清)和6个对照组,采用qRT⁃PCR技术检测各组不同时间点胞内和上清中PRRSV N基因的拷贝数,确定猪新鲜血清对PRRSV感染PAMs的作用;采用免疫阻断技术将PAMs分为FcR McAb阻断组、CR1⁃like McAb阻断组、共阻断组及3个对照组,qRT⁃PCR技术检测PRRSV N基因拷贝数变化,确定免疫粘附受体CR1⁃like对PRRSV感染PAMs的影响。[结果]抗PRRSV血清在PAMs上的中和抗体效价为1∶5.37;qRT⁃PCR结果成功筛选出1:20稀释度的抗PRRSV血清对病毒的复制具有促进作用;ELISA检测猪新鲜血清C3b、C4b和CH50浓度随PRRSV感染时间延长呈降低趋势;qRT⁃PCR结果显示,猪新鲜血清可以与1∶20稀释度抗PRRSV血清协同促进PRRSV的复制;qRT⁃PCR、免疫阻断技术得出1∶20稀释度抗PRRSV血清、猪新鲜血清协同促进PRRSV感染增强不只依赖于FcR,还与CR1⁃like有关。[结论]体外条件下,PAMs表面的CR1⁃like是介导PRRSV感染PAMs过程中产生ADE效应的分子之一,可与FcR协同促进PRRSV感染PAMs。

CD163单等位基因表达的iPAMs细胞系的构建及其介导PRRSV感染的特征分析

【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得CD 163(cluster of differentiation 163)单等位基因表达的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并探究其介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染的特征,为深入研究CD 163基因在PRRSV感染中的作用机制奠定基础。【方法】在猪CD 163基因外显子1区域设计8条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接到pX458载体中,通过T7E1酶切试验检测不同sgRNA载体的活性;将活性较高的3条sgRNAs表达载体电转染到iPAMs中,通过流式细胞术分选单克隆细胞,对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定、蛋白表达检测、脱靶分析以及PRRSV感染分析。【结果】在设计的8条sgRNAs中有3条基因编辑效率在28%以上。基因型鉴定结果表明,50株片段敲除的单克隆细胞中有4株符合预期的CD 163单等位基因表达的iPAMs,效率为8%。蛋白表达检测和脱靶分析结果显示,CD 163单等位基因表达的iPAMs中CD163蛋白表达量显著下降(P<0.05),且在预测位置未发生脱靶现象。PRRSV感染分析显示,CD 163单等位基因表达的iPAMs可以正常感染PRRSV,病毒拷贝数和PRRSV-N蛋白表达量与野生型细胞无显著差异(P>0.05)。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统构建了可以正常感染PPRSV的CD 163单等位基因表达的iPAMs,为阐明CD163在猪繁殖与呼吸综合征传染病中所起的作用以及培育抗病猪新品种奠定了基础。

猪PCSK9单克隆抗体的制备及其在PRRSV感染过程中的应用

实验室前期shot-gun质谱结果表明PCSK9在PAM空细胞和PRRSV感染组PAM细胞间存在差异表达。为了深入研究PCSK9与PRRSV间的相互作用机制,本实验在体外合成猪PCSK9基因并克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28aPCSK9。利用该原核表达系统获得了高效表达的重组蛋白PCSK9(约75kDa),进一步通过镍柱亲和层析技术纯化重组蛋白PCSK9作为免疫原,皮下免疫5-6周龄的BALB/c小鼠(100ng/只),获得了1株产生PCSK9特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2A2B12)。应用此单克隆抗体对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染PAM细胞后的内源性PCSK9变化情况进行了检测。Western blot和IFA结果表明本实验制备的PCSK9单克隆抗体具有良好的特异性,抗体针对的表位位于PCSK9的C端结构域(463-705 aa);此外,Western blot结果表明PRRSV感染可抑制PCSK9蛋白的表达,过表达PCSK9对PRRSV的复制有明显的抑制作用。本研究中研制的抗体可为今后猪源PCSK9与PRRSV的相互作用研究提供工具支持。

PRRSV强弱毒感染PAM和Marc-145细胞入胞途径差异的研究

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪场最重要传染病之一,给全世界养猪业造成了持续的经济损害。减毒活疫苗免疫接种作为防控PRRS的有效手段在全世界范围内得到广泛应用。减毒活疫苗毒株是在猴源细胞系上连续传代获得的,导致其与亲本毒株在生物学特性上存在巨大差异,同时本实验室前期结果也提示HP-PRRSV野毒株和疫苗毒株在入胞途径上可能存在差异。Na^(+)/H^(+)交换的依赖是巨胞饮的标志性特征,阿米洛利(EIPA)是Na^(+)/H^(+)交换的特异性抑制剂,细胞骨架重排在病毒的入胞过程中发挥重要作用,细胞松弛素D(Cyt D)是肌动蛋白聚合的特异性抑制剂。分别利用EIPA和Cyt D预处理PAM和Marc-145细胞后接毒,对比强弱毒在两种细胞内病毒拷贝数、蛋白表达水平及子代病毒的释放上与空白对照组的差异。结果表明,PRRSV强弱毒均不利用巨胞饮途径感染Marc-145或者PAM细胞,但强弱毒在感染不同细胞时对肌动蛋白的依赖性存在明显的区别。本研究结果初步揭示了PRRSV野毒株和疫苗毒株入胞过程的差异,为进一步揭示PRRSV疫苗毒株致弱机制提供了前期基础。

表达PRRSV N蛋白稳定细胞系的构建与鉴定

旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板,通过PCR扩增N基因,并将其克隆到慢病毒载体中,获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装,获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞,嘌呤霉素初步筛选阳性细胞,筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因,通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系,为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。

猪TRIM56敲除细胞系的构建及在增殖PRRSV疫苗毒株中的应用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建1株猪TRIM56基因敲除的PAM-KNU细胞系,并探究其在增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)疫苗毒株中的应用。根据猪TRIM56基因组外显子区域设计合成2对特定的向导RNA引物,将引物磷酸化、退火并连接至Px459M和EZ-Guide-XH载体构建敲除质粒Px459M-sTRIM56-KO;将敲除质粒转染PAM-KNU细胞,经嘌呤霉素筛选、有限稀释法筛选获得单克隆细胞并扩大培养;通过RT-PCR、测序及Western blot筛选鉴定,最终获得了敲除细胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU;将PRRSV R98疫苗株感染野生型细胞及敲除细胞系,利用real-time RT-PCR、半数组织培养感染量(TCID_(50))以及Western blot检测PRRSV增殖情况。结果显示,TRIM56敲除细胞系构建成功,该敲除细胞系中sTRIM56基因编码区第929~2120位1192个碱基缺失,未检测到sTRIM56蛋白条带;敲除细胞系中PRRSV R98疫苗株病毒拷贝数、病毒滴度以及N蛋白表达均显著高于对照组。本研究为猪TRIM56抗病毒机制研究及PRRSV疫苗研发奠定了基础。

PRRSV受体蛋白CD163及其表达影响因素的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪出现繁殖障碍及仔猪出现严重呼吸道症状的急性传染病,给养殖业带来了严重的经济损失。众多科研人员通过对PRRSV受体的研究逐步了解到该病毒的受体种类和作用机制,在受体蛋白CD169、硫酸乙酰肝素、波形蛋白、DC-SIGN(CD209)、CD151、CD163和NMHC II-A(或MYH9)中,PRRSV主要是通过CD163受体入侵感染,而这过程中又有很多因素增强或减弱CD163的表达,从而增强或抑制PRRSV的感染。本文通过对PPPSV受体蛋白CD163的功能、CD163结构域与PRRSV感染之间的关系进行总结,进一步了解PRRSV的作用机制,以及通过对影响CD163表达因素的研究进行综述,以期为PRRSV受体蛋白CD163的后续研究提供一些思路及参考。