PRRSV CH-1R疫苗株N蛋白的克隆及原核表达

为了区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原是来自疫苗株还是野毒株,试验采用RTPCR和PCR方法从PRRSV CH-1R株中扩增出ORF7基因,通过T4连接酶将ORF7基因与p ET-28a(+)载体连接,导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,并以20%IPTG进行诱导表达。结果表明:重组菌可表达分子质量为16.0 ku的融合蛋白,且20%IPTG诱导3 h的表达效果最好;表达产物纯化后可得到纯度较高的目的蛋白,经Western-bolt分析可确认该蛋白为PRRSV CH-1R株N蛋白。说明在原核表达系统中可表达出PRRSV CH-1R株N蛋白,并且能够使其携带上多聚组氨酸(6×His-tag)标签,形成N-His融合蛋白,使该蛋白与其他PRRSV经典株的N蛋白形成差异化。

短肽佐剂对猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗CH-1R株的免疫增强作用研究

为评价一种短肽佐剂对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1R弱毒疫苗的免疫增强效果,本研究分别采用CH-1R疫苗株单独(单独免疫组)、CH-1R疫苗株与短肽佐剂共同(共同免疫组)及生理盐水(对照组)免疫仔猪,4周后以高致病性PRRSV(H P-PRRSV)TJ-F5攻毒,并采用流式细胞术对攻毒前后淋巴细胞亚类T、Th、Tc及N K进行绝对和相对计数。结果显示攻毒后共同免疫组仅在第3 d淋巴细胞亚类数量显著下降后回升,28 dTc/T显著高于单独免疫组,临床症状和各组织器官病理变化轻微;单独免疫组在攻毒后第3 d淋巴细胞亚类数量显著下降后回升,之后于第14和15 d再次显著下降后又回升,临床症状和各组织器官病理变化比共同免疫组严重,但比对照组明显减轻。单独免疫组、共同免疫组及对照组的攻毒保护率分别为40%、80%、0。研究结果表明,短肽佐剂配合CH-1R弱毒疫苗具有缓解H P-PRRSV TJ-F5的免疫抑制、增强细胞免疫及提高免疫保护力的作用;在抵抗H P-PRRSV TJ-F5攻击时,共同免疫组的免疫保护力明显高于单独免疫组。

猪繁殖与呼吸综合征CH-1R弱毒株低血清培养工艺研究

Marc-145细胞是用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)培养的易感细胞。通过对PRRSV CH-1R高敏感Marc-145/D2克隆细胞株培养特性的研究,以及分析病毒在不同血清浓度细胞维持液中的增殖水平,筛选出最佳培养条件。结果表明,以Marc-145/D2克隆细胞株无血清转瓶培养PRRSV CH-1R的抗原效价可达到108.0TCID50/mL以上。

感染PRRSV弱毒株后仔猪病毒血症和抗体产生规律

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1R弱毒株在仔猪体内的增殖及其诱导抗体产生的规律。本试验将PRRSV CH-1R弱毒株肌肉注射免疫9头45日龄健康仔猪,于免疫后0,7,14,28,35和42d通过前腔静脉采取新鲜血液,利用实时荧光定量PCR方法检测PRRSV在猪体内的增殖,ELISA方法检测抗PRRSV抗体,并利用基于PAM细胞建立的中和试验检测中和抗体。结果显示:PRRSV CH-1R弱毒株免疫仔猪后7d病毒在100%仔猪体内开始复制,免疫后7~14d时100%仔猪出现病毒血症,且病毒拷贝数达到最高,28~35d时56%仔猪病毒血症消失,42d时67%仔猪病毒血症消失;ELISA检测发现免疫后7~14d仔猪均未产生抗PRRSV抗体,28d时44%仔猪开始产生抗PRRSV抗体,42d时78%仔猪抗PRRSV抗体水平达到最高,有2头猪在0~42d一直未检测到抗PRRSV抗体;利用基于PAM细胞上建立的检测中和抗体的方法检测,免疫后7~14d均未产生中和抗体,28d时仅有22%仔猪产生低水平的中和抗体,35d时78%仔猪产生中和抗体,且在42d时其中和抗体水平达到最高。结果表明,PRRSV CH-1R弱毒株免疫仔猪后病毒血症在7~14d达到高峰,免疫接种后28~42d大部分仔猪病毒血症逐渐消失,即病毒增殖随时间呈递减趋势;抗PRRSV抗体及中和抗体均在免疫接种后28d开始出现且在42d抗体水平达到顶峰,即抗体水平随时间呈递增趋势。抗PRRSV的ELISA抗体与中和抗体水平呈正相关,而抗PRRSV中和抗体水平与病毒增殖呈负相关,但是有33%仔猪体内一直存在病毒,表明PRRSV CH-1R弱毒株免疫仔猪后,可诱导较低水平的抗体免疫保护反应,同时也可引起较低水平的病毒血症。