2013—2021年云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行与混合感染状况调查

【目的】调查云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的流行规律和混合感染情况。【方法】采用分子生物学方法对2013—2021年间的3112份血液样品进行PRRSV核酸检测,并进一步分析其流行和混合感染情况。【结果】检测样品中,有801份样品为PPRSV阳性,阳性率为25.74%,二重、三重和四重混合感染率分别为41.20%、12.48%和1.87%;不同生长阶段猪群的PRRSV感染程度差异较大,生长育肥猪感染最严重(33.24%);相对于育肥场和散养户,种猪场的感染程度较轻,三者的感染率分别为27.94%、28.94%和14.29%。对不同毒株类型分析发现:高致病性毒株和经典毒株仍是主要的流行毒株,分别占毒株数的58.49%和22.64%,但占比呈逐年下降趋势。于2019年和2021年在云南省内分别发现了类NADC30毒株和类NADC34毒株,分别占毒株数的15.09%和3.77%,其感染率呈逐渐上升趋势。【结论】猪繁殖与呼吸综合征仍是影响云南省生猪产业健康发展最重要的疫病之一,表现形式以和其他疾病混合感染为主。随着新毒株的发现,云南省PRRSV基因更加多样,防控形势愈加复杂。

猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)S_A毒株的分离与鉴定

从仔猪内脏分离到一株猪繁殖呼吸综合征病毒 (PRRSV)毒株 ,该毒株能在Marc 14 5细胞上增殖致细胞病变 ,该病变能被PRRSV美洲型阳性血清所抑制 ,不被乙脑病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒阳性血清所抑制 ,经美洲型PRRSV荧光抗体染色呈阳性反应 ,电镜观察到直径 5 5nm左右的病毒粒子 ,属RNA病毒 ,接种阴性仔猪未见临床症状异常 ,但血清学阳性。命名该分离毒为PRRSV SA 毒株。

PRRSV强弱病毒株嵌合感染性克隆的构建及鉴定

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)与致弱PRRSV的重组病毒,本研究在PRRSV致弱株APRRS的全长感染性克隆pAPRRS与HP-PRRSV感染性克隆pJX143的基础上,利用SOE-PCR技术将强弱毒的nsp2区域进行互换,构建了nsp2基因替换的强弱毒PRRSV嵌合感染性克隆。将构建的嵌合克隆转染MA104细胞,4 d后观察到典型的细胞病变。通过RT-PCR和间接免疫荧光证明获得了强弱病毒株之间nsp2基因互换的嵌合病毒。这些嵌合病毒的构建和相应反向遗传操作平台的建立,为进一步研究HP-PRRSV的致病机制及相关疫苗的研发奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒缺失变异株的基因组特征

对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分离株HB-2(sh)/2002的全基因组序列进行了测定与分析.该毒株基因组全长为15 373 nt(不包括PolyA尾),与国内外美洲型PRRSV分离株全序列相似性介于88.7%～95.1%之间.序列分析表明,该毒株是1个天然存在缺失的变异毒株,其ORF1a的Nsp2存在编码12个氨基酸的连续36个核苷酸的缺失,ORF3存在编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失.这是国内外首次发现PRRSV存在缺失变异现象,研究结果补充和丰富了PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础.

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核蛋白基因在原核系统中的高效表达与初步应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_1a株核蛋白基因克隆至原核表达载体pET30a的多克隆位点中 ,经鉴定后得到重组质粒pET30a_N ,将此重组质粒转化到受体菌BL2 1中 ,用诱导剂IPTG分别以不同浓度进行诱导 ,并在不同诱导时间进行采样 ,经处理后做SDS_PAGE、Western_blot分析 ,并以此为包被抗原进行ELISA检测 ,结果发现以终浓度为 1mmol/L的IPTG进行诱导 ,4小时后表达可达到高峰 ,其大小约为 2 3kD ,薄层扫描结果表明该蛋白表达量约占菌体蛋白总量的 32 % ,该蛋白不仅与PRRSV阳性血清能发生特异性反应 ,而且可被PRRSV抗N蛋白单抗所识别 ,证实此大量表达的蛋白为核蛋白。将此表达产物应用ProBondTM纯化系统进行纯化 ,其纯度可达到 91% ,纯化后的蛋白以 5 0 μg/孔包被 96孔板 ,检测来自不同地区送检的猪血清 ,同时以全病毒ELISA为对照 ,结果发现二者的符合率高达 93.3% ,而应用该蛋白进行检测其反应更为敏感 ,且背景低 ,制备过程简单 ,这将为今后应用该蛋白作诊断抗原检测PRRSV奠定了基础。

我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因的遗传变异分析

参考Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332的ORF5基因序列,设计 并合成了一对引物,对来自福建、浙江、山东等地的PRRSV分离毒株进行RT-PCR扩增,获得约748 bp的 DNA片断,将其分别克隆入pMD18-T载体中,并进行测序。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCC VR-2332、CH-1a、MLV、LV等毒株的ORF5序列进行比较,结果表明:SHD1与FJ14、MLV、ATCCVR-2332 同源性高达98．5％,与CH-1a同源性为91．0％,与其它毒株同源性为86．6％-88．4%;FJ14与MLV、ATCC VR- 2332同源性为99．3％-99．7％,其余分离毒株在遗传关系上和CH-1a又分为明显的两个群,显示近年来各地 PRRSV分离毒株与CH-1a株的遗传差异越来越大。

猪繁殖与呼吸综合征病毒Resp株单克隆抗体的研制

利用Marc1 4 5细胞增殖和凝胶层析纯化的猪繁殖与呼吸综合征 (PRRSV)Resp株 ,建立了酶联免疫吸附试验 (ELISA)单克隆抗体筛选技术。在猪肺泡巨噬细胞 (PAM)上增殖、浓缩、纯化PRRSV并免疫Balb/c小鼠 ,用PEG - 1 50 0进行细胞融合。结果表明 ,细胞融合率为 70 6 % ,初检PRRSV抗体阳性率为 6 3 %。经 2次亚克隆获得了 2株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,其单抗间接荧光抗体试验 (IFA)可用于检测细胞培养物中的PRRSV抗原 。

猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株ORF5基因在大肠杆菌中的表达

根据测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株(PRRSV GD)的序列,设计一对引物。用保存的PRRSV GD 的ORF5 的克隆产物pMD ORF5 质粒作为模板,扩增ORF5基因。将该片段定向插入到原核表达载体pBAD/gⅢC中,转化大肠埃希菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后,用阿拉伯糖诱导表达。用Western blotting鉴定表达蛋白,证明ORF5基因得到表达。

中国与美国RFLP 1-4-4 lineage1C变异株同一分支PRRSV的全基因组序列分析

2020年美国报道了高致病性的RFLP 1-4-4 lineage 1C PRRSV变异株,其对猪的致死率达到17.5%。为了分析美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国当前流行的PRRSV的关系,本研究对中国不同基因亚型的PRRSV与美国新发1-4-4 lineage1C PRRSV变异株进行遗传演化分析,结果显示,中国类NADC34 PRRSV与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株关系密切;其Nsp2推导氨基酸序列比对结果显示,中国类NADC34 PRRSV与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株在Nsp2区域存在相同的分子特征,即100个氨基酸(aa328~aa427)的连续缺失。PRRSV基因重组分析结果显示,美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株是以类NADC34 IA14737-2016株为母本毒株,并由IA/2014/NADC34和NADC30病毒株提供重组基因片段的重组病毒,而中国早期的类NADC34 PRRSV是以IA/2014/NADC34株为母本毒株的重组病毒。美国早期的类NADC34 PRRSV对仔猪的致病力差异较大,而中国早期的类NADC34 PRRSV对仔猪多为中、低致病力。此外,中国HLJZD22-1812株与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株具有类似的重组模式、相同的Nsp2缺失特征、相同的1-4-4 ORF5限制性片段长度多态性(RFLP)模式,且均属于lineage1C分支。本研究结果首次表明美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国类NADC34(PRRSV)属于同一亚型分支,且具有一致的分子特征,提示类NADC34 PRRSV在我国的流行及演化情况需高度关注。

一株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及遗传变异分析

为了解广西地区的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异及流行情况,本实验室从广西某发病猪场采集到的猪肺脏组织中检测到1株PRRSV,命名为GXNN1839,并对该毒株进行病毒的分离鉴定、GP5和Nsp2的测序分析。结果显示:该毒株可在PAM细胞上分离增殖,有明显的细胞病变,通过IFA试验可以检测到细胞内PRRSV N蛋白的表达;对分离株的GP5基因测序和遗传演化分析显示,该毒株为美洲型PRRSV,且与美国病毒株NADC30在同一分支上,同源性分析表明,GXNN1839与北美病毒株NADC30的同源性最高,为93.1%,与我国分离的NADC30-like病毒株CHsx1401的同源性为91.7%,与VR-2332、CH-1a的同源性分别是87%、86.7%,与高致病性病毒株JXA1的同源性为86.7%,与欧洲株Lelystad-virus(LV)同源性为62.0%;Nsp2氨基酸序列对比显示,该毒株具有和北美毒株NADC30相同的131个氨基酸的不连续缺失(111+1+19)。该毒株的分离为下一步研究PRRSV NADC30-like病毒株致病性和了解广西地区的PRRSV的遗传变异及防控措施提供了借鉴意义。

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株RT-PCR鉴别诊断技术及其临床应用

【目的】建立能针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的RT-PCR鉴别诊断技术,为有效防控猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)提供技术支撑。【方法】根据GenBank中已发表的PRRSV Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-PCR诊断技术,并进行特异性、敏感性试验及临床应用。【结果】建立的RT-PCR能同时扩增获得两条大小与预期结果一致的特异片段,即332bp(经典株)和241bp(变异株),根据其大小可将两者鉴别区分;而且具有较强的特异性和较高的敏感性,能同时检测出100fg PRRSV经典株和变异株的RNA含量;临床应用发现37份可疑病料中PRRSV经典株占24.32%,变异株占51.35%,其余样品为阴性。【结论】该RT-PCR技术能有效鉴别PRRSV经典株和变异株,且具有快速简便、特异敏感的特点,在临床诊断方面具有广阔的应用前景。

VR-2332菌株猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗功效的相关研究

自20世纪80年代后期出现以来,猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）已经在大多数养猪国家流行起来.PRRS的病原体是PRRS病毒（PRRSV）,它是单股正链RNA病毒.2006年,中国出现了导致所有年龄的猪高热和死亡的高致病性PRRS（HP-PRRS）.高毒性2型PRRSV已被检测到,并鉴定了非结构蛋白2（nsp2）中常见的缺失位点.HP-PRRS由具有共同遗传特征的病毒引起,现在已经迅速蔓延到东南亚各国.在这里,我们以无特定病原体（SPF）仔猪作为试验对象,通过评估临床特征,血清、唾液和器官中的病毒载体及肉眼和微观病变来评估越南2010年分离株的体内致病力和毒力以及Ingel-vacPRRS MLV的有效性.

猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1001株和GX1002株全基因组分子特征分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异情况及分子遗传特征，采用RT—PCR分段扩增2010年PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株基因片段，经克隆、测序、拼接，获得2个分离株的全基因序列。

猪繁殖与呼吸综合征及其病毒变异株的危害控制

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,又称蓝耳病,是侵害猪繁殖系统和呼吸道的传染病,病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。随着PRRSV的变异、疫病的混感和养猪条件的恶化,

PRRSV野毒株细胞嗜性改变的分子机制:GP2a-GP3蛋白的变异发挥关键作用

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）是引起猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病原,该病毒分为两个基因型,即以LV为代表的欧洲型（基因Ⅰ型）和以VR2332为代表的美洲型（基因Ⅱ型）。

用PRRSV大、小空斑变异株双重感染新生和三周龄仔猪的试验

现已证实,猪生殖——呼吸道综合征(PRRS)病毒(PRRSV)主要引起妊娠后期母猪胎盘传递感染,使胎儿随后发生死亡.有些胎儿出生时有病毒血症,或具有抗PRRSV特异性抗体.这些乳猪出生时常为弱仔,进而死亡,有的没多大健康问题而存活.

美PRRS不同病毒株的致病力差异

据美国Halbur的研究报告指出,PRRSV弱毒株荷兰株(Lelystad)和美国株VR-2431在小猪肺脏所引起的间质性肺炎硬变区约为6.8—9.7％。而美国强毒株VR-2385则会引起小猪肺脏间质性肺炎硬变区达54.2％,同时呼吸道淋巴组织的病变也都明显的比弱毒株引起的严重。另外Mengeling等以PRRSV感染繁殖母猪的试验结果也表明,不同毒株所致胎猪死亡率也是不同的。疫苗株RescPRRS致胎猪死亡率最低的为5％。弱毒株VR-2431致胎猪死亡率为27％。