木瓜环斑病毒外壳蛋白与核酸酶嵌合基因转化番木瓜胚状体的研究

以农杆菌ＬＢＡ４４０４介导木瓜环斑病毒外壳蛋白（ＰＲＳＶ－ＣＰ）与核酸酶（Ｎｕｃｌｃａｓｅ）嵌合基因，通过振动共培养法转化番木瓜子叶型胚状体，在选择培养基上筛选诱导再生转基因植株。ＮＰＴⅡ分析和ＳＯｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔＤＮＡ分子杂交结果表明，ＰＲＳＶ－Ｃｐ－Ｎｕｃｌｅａｓｃ嵌合基因已整合到番木瓜核基因组中。

结核病Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗免疫保护效果研究

目的研究Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法将雌性C57BL/6N小鼠40只,随机分为5组,即Mtb8.4/hIL-12嵌合基因、Mtb8.4基因疫苗组、BCG组、空载体组和PBS组。小鼠脾细胞培养上清液检测细胞因子水平;并按效靶比例分别为100∶1、50∶1、10∶1进行细胞毒性T细胞(CTL)杀伤检测。用结核杆菌H37Rv强毒株静脉攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-2分泌增加,IL-4分泌减少,特异性CTL活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻,其效果优于卡介苗(BCG)组和Mtb8.4基因疫苗组。结论hIL-12与Mtb8.4构建成嵌合基因疫苗后,使Mtb8.4基因疫苗的免疫效力得到很大提高。

嵌合基因δKρF在转基因小鼠内的组织特异性表达

本文报告了鸡δ晶体蛋白基因的启动子,被Friend脾病灶形成病毒(SFFV)的长末端重复顺序(LTR)取代后的嵌合基因δKpF在转基因小鼠内的表达特性。采用显微注射方法,将含有δKpF基因的重组质粒pδKpF DNA导入小鼠受精卵的雄原核,再将其植入假孕小鼠的输卵管内,经生长发育,产出小鼠35只。以DNA-DNA分子杂交分析,发现其中1只小鼠的基因组DNA中整合有所导入的δKpE基因。再以免疫酶标记方法检测,发现δKpF基因在转基因小鼠内能够表达,而且具有组织特异性。作者认为,与δ晶体蛋白基因组织特异性表达有关的调节顺序位于+677bp之后。这与Hayashi等(1985)以培养细胞研究的结论不一致。

汉滩病毒G1S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G1片段与S基因0.7kb片段嵌合基因的重组腺病毒。方法构建含有汉滩病毒G1S0.7嵌合基因的转移载体pShuttle-G1S0.7，然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连，电转化E.coli JM109，获得重组腺病毒Adeno-G1S0.7 DNA，转染HFX293细胞得到重组腺病毒。进一步对重组腺病毒的滴度和表达产物进行鉴定。结果构建的含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒，滴度可达10^13～10^15 PFU／L；该重组腺病毒感染Vero-E6细胞后，表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1的特异性单抗（mAb）所识别的融合蛋白。结论利用腺病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G1生物学活性的融合蛋白，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。

基因工程重组嵌合抗原作为丙型肝炎诊断试剂的应用

利用基因工程重组技术获得了三种嵌合抗原，两种为丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区核壳蛋白Ｃ２２和ＮＳ３非结构区Ｃ３３ｃ双表位的嵌合抗原Ｂ１和Ｂ２，另一种是既具有上述两段优势抗原，还包括ＮＳ４非结构区Ｃ１００多表位的嵌合抗原Ｃ２５。在大肠杆菌水解酶阴性的Ｂ株菌中表达的产物，经ＳＤＳ一ＰＡＧＥ分析，Ｂ１、Ｂ２和Ｃ２５嵌合抗原分子量分别为４３、５３和７０ｋＤ，抗原蛋白表达量分别各占电泳蛋白条带的４０％、１０％和３５％左右。３个嵌合抗原的免疫活性分析证明，它们都具有相应区段的免疫活性。用嵌合抗原分别组装成ＥＩＡ试剂盒，经国家ＨＣＶ诊断试剂质控参比血清验证，Ｂ１嵌合抗原的抗体检出率为９５％Ｂ２嵌合抗原为９１％，Ｃ２５为９４％，均高于Ｃ３３ｃ和ＭＡＰＣＰ１９混合抗原（８８％）。Ｂ１嵌合抗原与核壳蛋白Ｃ区和非结构ＮＳ４区（Ｃ一ＮＳ４）双表位化学嵌合多肽抗原联合应用，抗体检出率高达９７％，完全符合国家ＨＣＶ诊断试剂质控要求。

人/鲑降钙素嵌合基因在大肠杆菌中的串联表达

人工合成人/鲑降钙素嵌合基因,用同尾酶法构建多拷贝串联基因表达质粒pLEX-nCT(n=1,2,3,4,5)(单个降钙素基因之间用一段编码柔性连接肽的DNA连接),并在大肠杆菌GI724中表达。Western blotting结果显示,串联多肽具有人源降钙素的抗原性。

汉滩病毒M和S基因不同拼接方式嵌合基因免疫效果的研究

本文在前期工作的基础上,构建了汉滩病毒76-118株M基因G2片段与S基因5'端0.7Kb片段的嵌合基因真核表达载体pcDNA3.1-G2S0.7及pcDNA3.1-S0.7G2;用该质粒免疫BALB/c小鼠。结果表明两种质粒免疫小鼠可同时诱导产生抗汉滩病毒核蛋白(NP)及糖蛋白(GP)特异性的抗体,且前者刺激产生的抗体效价明显高于后者。淋巴细胞增殖实验表明,pcDNA3.1-G2S0.7组免疫小鼠脾细胞时NP及GP的增殖指数均明显高于空载体对照组,而pcDNA3.1-S0.7G2组未检测到其淋巴细胞有明显的增殖。这说明汉滩病毒M基因G2片段及S基因0.7Kb片段的嵌合基因既可刺激机体产生特异的抗汉滩病毒体液免疫应答,也可刺激机体产生特异的细胞免疫应答。不同拼接方式对嵌合基因免疫效果有很大影响,嵌合基因G2S0.7这种拼接方式明显优于S0.7G2。

Ⅰ型人免疫缺陷病毒gag-gp120嵌合基因核酸疫苗的构建与鉴定

目的 :构建含Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (HIV 1) gag gp12 0嵌合基因核酸疫苗的表达质粒。方法 :将gag和 gp12 0连接后的嵌合基因插入到真核表达载体 pVAX1中 ,构建真核表达质粒pVAXGE。用脂质体法将构建的重组质粒转染Hela细胞 72h后 ,取转染的Hela细胞进行RT PCR检测和和Dot ELISA分析。结果 :重组质粒转染细胞的总RNA中 ,可扩增出目的基因的转录产物。Dot ELISA的结果显示 ,目的基因在Hela细胞内得到表达。结论 :成功地构建了表达gag gp12 0嵌合基因的核酸疫苗质粒 ,为HIV

猪瘟病毒C株E^(rns)/E2嵌合基因表达蛋白单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定

目的:制备抗猪瘟病毒(CSFV)C株Erns/E2嵌合基因表达蛋白的单克隆抗体(mAb),探讨Erns/E2蛋白的分子结构和生物学功能。方法:在大肠杆菌RosettaTM2(DE3)中表达了猪瘟病毒(CSFV)C株Erns、E2蛋白主要抗原域的嵌合基因CSFVErns/E2蛋白;以纯化复性后的CSFVErns/E2为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗CSFVErns/E2 mAb;利用间接ELISA、Western blot、Dotblot方法鉴定mAb生物学特性。结果:获得了1株稳定分泌抗CSFVErns/E2融合蛋白的单克隆杂交瘤细胞系C8株,该株mAb的细胞培养上清效价为1∶6400,小鼠腹水效价1∶2×105。其免疫球蛋白亚类为IgG1。间接ELISA和Western blot结果显示该株mAb不与猪瘟C株细胞毒、pET-32a标签蛋白反应,仅与融合表达的CSFVErns/E2蛋白存在特异性反应。Dot blot结果表明其识别的抗原表位为E2蛋白的RSGL-CPFDTSPV氨基酸序列。结论:获得了一株能特异识别E2蛋白抗原表位的mAb,为进一步研究CSFV的分子结构及功能奠定了物质基础。

抗CD3基因工程嵌合抗体IgG在哺乳动物细胞中的表达和活性测定

利用基因工程方法将鼠源性抗CD3抗体HIT3a的可变区和人源抗体 (IgG)的完整的恒定区连接起来 ,构建全抗型抗CD3嵌合抗体 ,该型抗体具有较低的免疫源性可作为免疫抑制剂应用于器官移植 ,减少受体产生免疫排斥 ,提高移植器官的存活率。利用PCR方法从抗CD3ScFv重组噬菌体表达载体pCANTAB 5E上扩增抗CD3抗体的轻链和重链可变区 ,将轻链和重链可变区组装到含有人抗体 (IgG)恒定区的表达载体中 ,构建抗CD3嵌合抗体IgG的轻链和重链表达载体PKN10 0和PG1D10 5 ,并用脂质体法共转染CHO细胞。结果证明 ,抗CD3嵌合抗体的VL 和VH 与HIT3a抗体的VL 和VH 完全相符 ,ELISA和Westernblot检测结果证实转染细胞的培养上清中含有抗CD3嵌合抗体IgG的表达 ,表达产物能与Jurkat细胞结合 ,并能竞争性抑制HIT3a抗体和Jurkat细胞结合活性 ,3H TdR掺入实验表明 ,抗CD3嵌合抗体与亲代抗体HIT3a一样 ,具有促进外周血单核细胞增殖的作用。我室构建的全抗型抗CD3嵌合抗体分子表达载体可在CHO细胞中稳定表达 ,表达产物有较好生物活性 。

Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫原性

目的:构建克隆结核分枝杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗,并在COS7细胞中表达,研究该疫苗的免疫原性。方法:克隆Mtb8.4/hIL12嵌合基因,并导入真核表达载体pCIneo中,构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组真核质粒。用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等鉴定后,转染COS7细胞,用RTPCR和Westernblot鉴定Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平的表达。用Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫C57BL/6N小鼠,收集脾细胞培养上清检测细胞因子的水平,并用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤作用。结果:pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒构建成功。以其转染COS7细胞后,Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平获得表达。Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,IFNγ和IL2的分泌增加,IL4的分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强。结论:成功地构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒,并在COS7细胞中表达。构建的Mtb8.4/hIL12基因疫苗具有较强的免疫原性,可明显诱导CTL的杀伤活性。

RTS启动子与GUS的嵌合基因在转基因水稻花药中的专一性表达

通过PCR扩增 ,从籼稻品种IR36中克隆了RTS启动子的DNA片段 ;序列分析表明 ,所克隆的DNA片段含 12 5 7个核苷酸 ,与Lee等 (1996 )报告的序列比较 ,核苷酸同源性为 97.1% ;将 - 12 2 8～ + 2 5的RTS启动子区段与GUS编码区组成的嵌合基因插入双元载体的T DNA中 ,经根癌农杆菌介导转化 ,得到转基因水稻植株。GUS活力检测表明 ,此嵌合基因不仅能在花药绒毡层 ,而且还在花药表皮细胞、药室内壁以及花粉中表达 ,而 - 783～ + 2 5的 5’上游区与GUS编码区组成的嵌合基因则未在转基因水稻的花药中检测到其表达。

P_(SAG12)-ipt嵌合基因转化樱桃番茄的研究

利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法将嵌合基因PSAG12-ipt导入樱桃番茄,经双重PCR检测和基因组总DNASouthern杂交测验,共获得17株转基因植株。田间生长实验观察结果显示,这17株转基因植株生长发育及形态正常,但其中的14株长势明显好于对照。对14株中的2株进行叶片叶绿素、细胞分裂素检测结果表明,转基因植株基本定型叶下部,不同叶位叶片叶绿素、细胞分裂素含量明显高于对照,基本定型叶上部叶片与对照基本一致,同一叶位叶片比对照延缓衰老15～20d。

两种尘螨1类变应原嵌合基因的原核表达及生物活性鉴定

目的原核表达尘螨1类变应原（粉尘螨1类变应原仇叩和户尘螨1类变应原Derpl基因）的嵌合基因R8，并检测其生物活性。方法以含嵌合基因R8的pUCm-T重组质粒为模板，用Derel的特异性引物进行PCR扩增，产物经酶切后与载体pET28a（＋）连接，连接产物转入大肠埃希菌（E.coli）BL21感受态细胞，并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后纯化，十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS．PAGE）检测；纯化后的蛋白用ELISA检测其与粉尘螨过敏患者血清（IgE）的结合能力，同时以重组rDerfl和rDerP1蛋白作为对照。为检验嵌合蛋白R8的免疫原性，将75只BALB／c小鼠随机均分为5组，分别为PBS组（阴性对照组）、rDerf1组、rDerP1组、R8组和哮喘组（阳性对照组）。除PBS组外，其余各组分别于第0、7和14天每鼠腹腔注射（0．1μg/μl）粉尘螨注射液100μ1，第21～27天每鼠每天雾化吸入0．5μg／ml粉尘螨注射液悬浊液，30min／d。rDerf1组、rDerP1组和R8组于第25～27天雾化前30min．分别腹腔注射100μg／ml的rDerf1、rDerP1和R8蛋白各200μl进行特异性免疫治疗，PBS组用等量PBS进行腹腔注射和雾化吸人。所有小鼠于第27天雾化吸入后24h气管切开，用1mlPBS进行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液（BALF），检测γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）的水平。结果SDS-PAGE结果显示，R8表达产物的蛋白相对分子质量（Mr）约为35000。EUSA检测结果显示，嵌合蛋白R8与粉尘螨过敏患者血清IgE的结合力为（37．03±12．46）μg／ml，显著低于rDerf1[（80．44±15．50）μg／ml]和rDerP1[（90．79±10．38）μg／ml]（P〈0．01）。动物实验结果显示，R8组IFN-γ水平[（343．43±38．79）pg／ml]与rDerfl组[（322．98±30．36）pg／m1]和rDerP1组[（314．97±33．89）pg/ml]的相比，差异均无统计学意义（P〉0．05）；与PBS组[（393．93±50．68）pg/ml]和哮喘组[（208．44±46．11）pg／m1]相比，差异均有统计学意义（P〈0．01）。R8组IL4水平显著低于其他各组水平（P〈0．05或0．01）。结论表达了具有低变应原性和高免疫原性的尘螨1类变应原嵌合基因R8。

RNA/DNA嵌合分子介导的高效基因修复

本文介绍了RNA/DNA嵌合分子介导的高效基因修复技术。这一技术是1996年开始发展起来的全新技术 ,它通过人工合成的双链开环RNA/DNA嵌合分子转染细胞而使特定基因靶位点产生单碱基改变 ,从而修复突变基因。这一技术高效 (目前最高可达50 %以上 )、特异性强、安全、无随机插入致变的危险、无免疫反应、无明显毒性 ,能够用于定点突变、基因敲除、动植物功能基因组学、药物遗传学等很多方面的研究 ,在不久的将来能够应用于人类基因治疗 ,具有很高的应用价值和医学前景。

油菜素内酯(BR)超敏感嵌合受体的构建和水稻转基因表达

将油菜素内酯(brassinosteroids,BR)超敏感受体激酶基因Sud1与水稻抗病受体激酶基因Xa21经体外点突变后构建了带SUD1LRR-JM结构域与XA21激酶域(kinase)的合成受体(chimera)基因SNRG1,同时构建了SUD1LRR突变体对照受体基因SNRGmL和XA21kinase突变体对照受体基因SNRGmK.应用基因枪(particlebombardment)转化技术成功将SNRG1,SNRGmL和SNRGmK导入粳稻模式品种台北309的胚性愈伤组织中,并由此获得了再生植株和细胞株.经PCR、Northernblot分子检测和表型观察证实外源基因已经转入并整合到水稻基因组.防卫基因表达的结果表明SNRG1可能已在体内微量的BR作用下,激发了水稻的防卫反应.该结果为进一步研究XA21激酶的抗性激发奠定了基础.

cmv-3′LTR嵌合启动子对逆转录病毒载体MFG滴度及外源基因表达的影响

为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默,进一步提高逆转录病毒载体MFG介导的外源基因的表达水平,同时探讨逆转录病毒3′端长末端重复序列(long terminalrepeat,LTR)内U3区对病毒基因表达的影响,将逆转录病毒载体3′端LTR内的U3区用cmv核心增强子、启动子序列替代,同时去除了3个与逆转录病毒载体启动子甲基化有关的序列NCR、DR,并以egfp为报告基因,构建了MFG egfp和MFG egfp cmv表达载体。结果显示:利用cmv启动子替代MFG载体3′端LTR的U3启动子序列,会显著降低MFG载体的病毒滴度及其介导的外源报告基因的表达。提示利用cmv启动子替代病毒载体的3′端LTR内的U3区,并不是提高MoMLV(moloneymurineleukemivirus)逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略。结果也同时提示:在MoMLV逆转录病毒3′端LTR的U3区,可能存在与病毒RNA加工、成熟及稳定性有关的信号序列。

异基因骨髓移植后嵌合状态的研究进展

骨髓移植是许多血液系统疾病和免疫缺陷性疾病的有效治疗措施 ,移植成功与否与供者细胞在受者体内的植入状况即嵌合状态的形成有关。由于造血干细胞输入量、供者和受者T细胞量、预处理方案以及移植时患者病情等因素的影响 ,可以形成不同形式的嵌合状态。如果受者的骨髓或外周血中完全是供者的细胞 ,则形成完全的供者嵌合状态 (CC) ;当检测到供者和受者两种细胞成分时 ,则为混合嵌合状态 (MC)。不同形式的嵌合状态 ,以及嵌合状态形式的不同演变趋势 ,其临床意义各不相同。检测嵌合状态的方法有多种 ,包括微卫星检测、染色体核型分析、血型转换、红细胞抗原、限制性片段长度多态性、可变数目串联重复序列以及现在最常用的PCR法。

应用嵌合基因实例拓展遗传学染色体畸变的教学

染色体结构变异,会扰乱机体的固有平衡系统,影响生殖和发育。在本科遗传学教学中,如何进一步诠释导致机体平衡系统紊乱的机理,是教师常面临的教学难题。一些嵌合基因(chimericgene)是染色体结构变异的产物,具有特异的生物功能,可能是致使固有平衡系统紊乱的原因之一,但很少见到在课堂或教科书中讲述与嵌合基因相关的内容。本文结合近年本团队对嵌合基因的研究成果及遗传学教学实践,以一个司法案例创设情境,引入嵌合基因实例,以激发学生的学习兴趣;进而通过对嵌合基因通性的梳理,辅助学生总结知识点,发展思维融汇力,从而拓展染色体畸变的教学,以期使学生对基因的变异及其功能有更深入的理解,提高遗传学教学效果。

人-鼠嵌合抗血小板单抗SZ-2 Fab片段基因的构建和表达研究

目的:降低鼠源性抗血小板单克隆抗体SZ-2的免疫原性,为其进一步研究、应用奠定基础。方法:用Trizol试剂从SZ-2杂交瘤细胞抽提RNA,应用RT-PCR技术,扩增出SZ-2重链、轻链可变区基因,克隆人载体pUCm-T,测序分析。应用基因重组技术,将SZ-2轻、重链可变区基因与人免疫球蛋白γ1重链CH1和κ轻链恒区基因进行拼接,构建人-鼠嵌合Fab片段基 因表达质粒pSW1-2 Fab/Hu,并导入大肠杆菌XL1-blue诱导表达。以ELISA、Western blot和瑞斯托霉素诱导血小板聚集抑制试验,对表达产物进行检测、验证。结果:克隆的基因序列符合小鼠轻、重链可变区基因的特征;表达质粒pSW1-2Fab/Hu拼接正确;在大肠肝菌中的表达量约为180μg/L;表达产物具有与血小板GPIb结合的特性并可抑制瑞斯托霉素诱导血小板聚集。结论:成功地克隆了SZ-2可变区基因;并表达了可溶性人-鼠嵌合Fab基因工程抗体。