结球甘蓝PRX基因家族全基因组鉴定与逆境条件下的表达分析

Ⅲ类过氧化物酶(class Ⅲ peroxidases, PRX)在植物生长发育和胁迫响应中发挥重要的作用,本研究利用生物信息学方法对结球甘蓝PRX基因家族进行鉴定,预测其结构和功能,并分析PRX基因在逆境条件下的表达模式,旨在明确甘蓝PRX基因家族的进化关系和功能。结果表明,结球甘蓝基因组中共鉴定出125个BoPRX基因家族成员,不均匀的分布在9条染色体上;编码氨基酸173-488 aa,大部分为亲水蛋白;亚细胞定位预测BoPRX基因大部分定位在叶绿体上。系统进化分析将甘蓝PRX蛋白分为5个亚族,每个亚族的成员都含有相似的外显子/内含子结构和蛋白质保守基序;启动子区域分析发现,BoPRX启动子序列中含有多种与激素和逆境等胁迫响应相关的顺式调控元件;基于转录组数据的热图分析显示,BoPRXs表达在叶绿体中最多。荧光定量PCR分析显示,6个BoPRX基因均受NaCl和PEG诱导上调;在ABA处理下,除BoPRX100外其余基因的表达在大部分时间被抑制,这些基因均受到ABA的差异调控,说明这些BoPRX基因都参与了ABA信号通路。综上所述,本研究揭示了PRX的复杂调控依赖于PRX的类型和信号分子,为进一步分析甘蓝PRX家族关键成员的功能提供了有价值的信息。

过表达和抑制表达2–Cys Prx基因烟草的生长特性和叶片光合功能

以过表达和抑制表达2–Cys Prx基因烟草(龙江911)为材料,测定和分析其生长特性和光化学活性。结果表明:过表达2–Cys Prx基因烟草的株高、根长、生物量显著高于非转基因烟草和抑制表达2–Cys Prx基因烟草;抑制表达2–Cys Prx基因烟草的PSⅡ反应中心电子传递速率(ETR)显著低于过表达2–Cys Prx基因烟草,过表达2–Cys Prx基因烟草的荧光曲线与Fm所围成的面积(Area)、2 ms时有活性反应中心的开放程度(Ψo)、吸收光能用于QA–以后电子传递的量子产额(φEo)、单位反应中心吸收光能用于电子传递的能量(ETo/RC)高于非转基因烟草,非光化学猝灭的最大量子产额(φDo)、单位反应中心耗散掉的能量(DIo/RC)低于非转基因烟草,而抑制表达转2–Cys Prx基因烟草呈现相反趋势。说明过表达2–Cys Prx基因烟草叶片吸收的光能更倾向于分配到光化学反应,以无效形式耗散的能量比例降低,这有利于为碳同化反应提供充足的同化力,以维持较高碳同化速率;抑制表达2–Cys Prx基因烟草叶片吸收的光能用于光化学反应的比例相对降低。

转2–Cys Prx基因烟草F_1幼苗叶片光系统Ⅱ光化学活性对干旱胁迫的响应

以转2–Cys Prx基因烟草(龙江911)为材料,测定和分析了干旱胁迫下转基因烟草的光化学活性。结果表明:干旱胁迫下,转2–Cys Prx基因烟草叶片OJIP曲线上K点和J点的相对荧光强度增加量明显低于非转基因烟草,而2 ms时有活性反应中心的开放程度(Ψo)明显高于非转基因烟草;增强2–Cys Prx基因的相对表达,增加了干旱胁迫下烟草叶片PSⅡ电子供体侧OEC的电荷分离能力和受体侧QA向QB的电子传递能力;转2–Cys Prx基因烟草叶片在干旱胁迫下,吸收光能用于QA–以后的电子传递的能量比例(φEo)明显大于非转基因烟草,而非光化学猝灭的最大量子产额(φDo)。2–Cys Prx基因的表达可以提高烟草幼苗叶片的光化学活性,并改变光能的分配来增强其抗旱能力。

过表达和抑制表达2-Cys Prx基因烟草的生长、生理特性和叶片光合功能对模拟酸雨的响应

为揭示2-Cys Peroxiredoxins(2-Cys Prx)基因在烟草龙江911抗逆中的功能,以过表达2-Cys Prx基因烟草、抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗为试材,研究了不同pH值的模拟酸雨对其生长指标、叶片生理生化特性和叶片光合生理的影响。结果表明:与对照相比,pH值4.0的模拟酸雨对3种基因型烟草的株高、叶面积、比叶重无明显影响,pH值2.5的模拟酸雨处理下,与对照相比,过表达2-Cys Prx基因烟草幼苗的株高无明显变化,抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗的株高显著降低;随着模拟酸雨pH值降低,3种基因型烟草叶片的硝酸还原酶(NR)活性、可溶性蛋白含量、SOD和APX活性、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、实际光化学效率(ФPSⅡ)、光化学猝灭系数(qP)、光系统Ⅱ潜在光化学效率(Fv/Fo)和细胞膜稳定指数逐渐下降,非光化学猝灭系数(qN)和H_2O_2含量逐渐增加,但在相同pH值的模拟酸雨处理下,过表达2-Cys Prx基因烟草各项生理指标均优于抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗。由此可知,增强2-Cys Prx基因在烟草中的表达可能提高烟草在模拟酸雨处理下的硝态氮利用能力,并在模拟酸雨处理造成APX活性下降时,清除叶绿体中的H_2O_2,使光合电子传递链保持稳定,增强烟草叶片的光合能力。

不结球白菜过氧化还原蛋白基因Brc2-Cys Prx的克隆和表达分析

[目的]双半胱氨酸型硫氧还蛋白过氧化物酶Brc2-Cys Prx是过氧化还原蛋白Peroxiredoxins(Prxs)的亚家族。Prxs是植物抗氧化酶防御系统的成员,对清除植物体内活性氧具有重要作用。本文旨在克隆和研究Brc2-Cys Prx基因在不结球白菜处于不同胁迫条件下的表达模式。[方法]以不结球白菜霜霉病抗病自交系‘苏州青’和霜霉病感病自交系‘矮脚黄’为试验材料,利用RACE技术克隆得到不结球白菜Brc2-Cys Prx基因。利用生物信息学方法对该基因进行信息学分析。采用qRT-PCR技术对不结球白菜叶片Brc2-Cys Prx基因在霜霉病菌侵染及NaCl、CdCl_2、PEG6000和ABA等非生物胁迫处理条件下的表达模式进行研究。[结果]Brc2-Cys Prx基因的c DNA全长为999 bp,其中开放阅读框长度为810 bp,共编码270个氨基酸。该蛋白不存在信号肽序列,预测相对分子质量为28.15×10~3,理论等电点为5.87。不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。该蛋白含有1个PRX_Typ2cys结构域,属于硫氧还蛋白超家族。系统进化分析表明:不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜和甘蓝型油菜进化关系最近。霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx基因表达呈逐渐上调趋势,在‘矮脚黄’中的表达与‘苏州青’相比上调迟钝,且该基因在‘矮脚黄’中的表达量一直低于‘苏州青’。0.2 mol·L^(-1)NaCl和200 g·L^(-1)PEG6000处理抑制Brc2-Cys Prx基因的表达;150μmol·L^(-1)CdCl_2处理促进Brc2-Cys Prx基因的表达,在24 h达到最大值;100μmol·L^(-1)ABA处理后,Brc2-Cys Prx基因表达上调,而12 h后,表达受抑制。[结论]霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx在抗性系‘苏州青’和感病系‘矮脚黄’中的表达存在差异,并且在抗病系中的表达量较高,推测Brc2-Cys Prx基因的高转录水平是抗病品种较之感病品种对霜霉病菌侵染具有更高抗性的原因之一。在非生物胁迫条件下,Brc2-Cys Prx基因具有不同的应答模式,推测可能是涉及到不同的物质或信号途径的原因。

肥城桃果实2-Cys Prx基因克隆、生物信息学分析及原核表达

为了深入研究2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号分子作用机制,结合了PCR技术和RT-PCR技术通过体外克隆的方法得到桃果实2-Cys Prx基因,通过对序列分析表明,2-Cys Prx基因全长1 424 bp,其中,编码区813 bp,共编码270个氨基酸。对其分子结构进行分析,2-Cys Prx蛋白分子量为29.7 ku,为疏水型蛋白,且是膜外蛋白。在线软件预测2-Cys Prx蛋白分子式为C1342H2110N348O403S4,分子量29.696 ku,由4 207个原子组成,理论等电点为6.23。使用Prot Scale分析该蛋白疏水性平均值为-0.126,说明2-Cys Prx为亲水性蛋白。TMHMM对跨膜结构进行预测,发现,2-Cys Prx氨基酸序列中不存在跨膜结构域,为膜外蛋白。此外,对该蛋白二级结构进行预测,发现2-Cys Prx有4个α螺旋结构、9个β折叠结构及无规则卷曲构成。系统进化树分析表明,肥城桃果实2-Cys Prx与其他植物氨基酸序列有较高同源性,其中与樱桃的亲缘关系最近,相似度达到了98.15%,表明植物体内2-Cys Prx具有较高的保守性。体外构建重组蛋白p ET-30a-2-Cys Prx成功在大肠杆菌BL21中表达,为下一步研究其功能与结构,从而探讨2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号作用机理奠定了基础。

凡纳滨对虾过氧化物还原酶3基因的分子克隆与功能分析

【目的】探究凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)过氧化物还原酶3(Peroxiredoxin 3,Prx3)基因(LvPrx3)的结构特征、组织分布和抗胁迫能力,为揭示凡纳滨对虾抗环境胁迫的应答机制提供理论依据。【方法】通过RACE克隆技术取得LvPrx3基因的全长cDNA序列,应用Clustal X、EditSeq、ExPASy、MEGA 6.0、SignalP 5.0和TMHMM 2.0等多个软件开展Prx3的生物信息学分析。运用半定量PCR和qRT-PCR技术检测分析LvPrx3基因在多种组织和不同胁迫条件下的表达响应情况。【结果】LvPrx3基因cDNA全长序列962 bp,内含45 bp 5′端非编码区(5′-UTR)、233 bp 3′端非编码区(3′-UTR)和684 bp开放阅读框(ORF),可编码227个氨基酸残基。LvPrx3的蛋白分子质量为25.09 ku,理论等电点(pI)为6.22,属于典型的2-Cys Prx,包含高度保守的“FYPLDFTFVCPTE”N端和“GEVCPA”C端。进化树分析显示,LvPrx3与节肢动物门的Prx亲缘关系较近,与斑节对虾(Penaeus monodon)的Prx氨基酸序列相似性最高,为98%。LvPrx3在眼柄中的表达量最高,肠道次之,在其他组织中的表达量无明显区别。脂多糖(LPS)注射后,眼柄中LvPrx3的表达分别在胁迫3 h和12~48 h时显著上调,而肠道中,LvPrx3表达量在胁迫3~24 h时均显著下调;在4-壬基酚(4-NP)胁迫后,眼柄中LvPrx3表达量在胁迫6~24 h后显著上调,24 h时最高,为对照组的4.11倍;肠道中的LvPrx3表达量在胁迫12 h时显著上调,在胁迫48 h时显著下调;以上显著性水平α均为0.05。【结论】LvPrx3基因属典型的2-Cys Prx,主要在凡纳滨对虾眼柄和肠道中高表达。脂多糖LPS刺激和4-NP胁迫可明显诱导凡纳滨对虾LvPrx3基因的表达水平,表明LvPrx3在对虾抵御病原菌感染及抗逆境胁迫的调控中发挥重要作用。

腓骨肌萎缩症一家系的临床特征与突变基因分析

目的分析腓骨肌萎缩症(CMT)一家系的临床特征与突变基因。方法回顾性分析1例CMT患者的临床特征并对其一级亲属进行家系调查。采用多重连接依赖式探针扩增技术分析该家系成员的突变基因,然后进行一代DNA测序验证。结果本例CMT患者青年发病,临床特征主要为缓慢进行性四肢远端肌无力伴肌萎缩,同时出现腱反射降低或消失;脑脊液检查白细胞计数和总蛋白水平轻度升高,肌电图检查四肢感觉和运动传导速度减慢或引不出波。该家系共两代4人,均为山东省常住居民,汉族,共发现1例CMT患者。突变基因分析发现,CMT患者同时存在缝隙连接蛋白B1(GJB1)基因c. 44 G→A(Arg15Gln)半合子突变和外周轴蛋白(PRX)基因c. 3208 C→G(Arg1070Gly)杂合变异;CMT患者姐姐同时存在GJB1基因c. 44 G→A(Arg15Gln)杂合突变和PRX基因c. 3208 C→G(Arg1070Gly)杂合变异;CMT患者母亲存在GJB1基因c. 44 G→A(Arg15Gln)杂合突变;CMT患者父亲存在PRX基因c. 3208 C→G(Arg1070Gly)杂合变异。结论本例CMT患者临床特征主要为缓慢进行性四肢远端肌无力伴肌萎缩,同时出现腱反射降低或消失;脑脊液检查白细胞计数和总蛋白水平轻度升高,肌电图检查四肢感觉和运动传导速度减慢或引不出波;本例CMT患者同时存在GJB1基因c. 44 G→A半合子突变和PRX基因c. 3208 C→G杂合变异,GJB1基因c. 44 G→A半合子突变为其致病性突变。

NNK长期暴露对小鼠毒性和Prx基因表达的影响

为研究4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)对小鼠的毒性以及与Prx(Peroxiredoxin)基因表达的关系,通过腹腔注射方式对小鼠进行NNK染毒(2.5和5.0 mg/kg),24周后利用苏木精-伊红(HE)染色和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术考察了NNK对小鼠肺、肝、肾和睾丸组织的毒性以及对Prx家族基因表达的影响。结果表明:①与对照组小鼠相比,处理组小鼠好斗性增强,进食量无较大变化,但染毒5周后,小鼠体质量降低。②处理组小鼠出现肺泡隔增生,肝血窦与肝细胞核增大,肾小球玻璃样变性、破碎,睾丸生精小管中各级精细胞明显减少。③在NNK胁迫下,Prx基因均被诱导;同一Prx基因在不同组织中的表达量不同,处理组小鼠肝组织中Prx基因的表达量最高,是对照组的34.8倍。④在对照组小鼠组织中Prx5基因表达量均较低,但NNK处理后其表达量升高,在5.0 mg/kg NNK处理后,其表达量升高更明显。因此,推测Prx5基因可能在NNK胁迫下发挥着重要的抗氧化作用。

一例Charcot-Marie-Tooth病4F型患儿的PRX基因变异分析

目的对1例临床怀疑为腓骨肌萎缩症的患儿进行基因变异分析,明确其可能的遗传学病因。方法应用二代测序技术,对该家系进行分子遗传学分析。结果测序结果显示患儿PRX基因(NM_181882)存在c.52G>T(p.Glu18X)和c.1390C>T(p.Arg464X)复合杂合变异,患儿父亲携带c.52G>T杂合变异,母亲携带c.1390C>T杂合变异,表明患儿的2个变异分别遗传自父亲和母亲,c.52G>T为未报道过的新变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南,c.52G>T(p.Glu18X)和c.1390C>T(p.Arg464X)均被判定为致病性变异(PVS1+PM2+PM3,PVS1+PM3-Strong+PM2+BS2)。结论PRX基因c.52G>T(p.Glu18X)和c.1390C>T(p.Arg464X)复合杂合变异可能是患儿的致病原因,新变异的检出丰富了PRX基因变异谱。

刚地弓形虫Peroxiredoxin基因的克隆及其融合蛋白的高效表达和纯化

目的克隆刚地弓形虫Prx基因,用IPTG诱导表达Prx融合蛋白并进行纯化。方法用PCR扩增目的基因片段并克隆至pGEX-6P-1载体,构建pGEX-6p-1/TgPrx原核表达载体;IPTG诱导表达Prx融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,GST亲和层析纯化融合蛋白。结果从弓形虫RH株DNA中扩增Prx基因,成功构建了弓形虫重组质粒pGEX-6p-1/TgPrx,并在大肠埃希菌(E.coli)中得到高效表达,表达的融合蛋白分子质量为51ku,该蛋白可被鼠抗弓形虫血清特异性识别。结论原核表达具有生物学活性的弓形虫重组Prx蛋白(rTgPrx),该蛋白有望用于弓形虫病免疫学检测。