应用RT-nested PCR检测猪传染性胃肠炎病毒

根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,利用Primer5.0程序软件,设计并合成了M基因的2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR,RT-nestedPCR方法,成功扩增出长度为1328bp和1037bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒(PEDV)片段。在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了快速检测TGEV的诊断方法。结果表明,RT-nestedPCR方法可用于检测猪传染性胃肠炎病毒,而且此方法简单省时、灵敏性高,可以作为检测RNA病毒的一种分子生物学方法。

RT-PCR检测人皮肤组织中趋化因子受体基因

目的 建立检测人体皮肤组织中趋化因子受体基因的RT PCR方法。方法 取 2 0例银屑病患者皮损及皮损边缘未受累部位皮肤 ,并收集 1 0例健康人皮肤 ,用 2 5g/L分散酶 (dispase)消化分离真皮、表皮 ,TRIzol提取RNA ,逆转录合成cDNA ,PCR扩增CXC型趋化因子受体CXCR2片段。结果 银屑病患者皮损部位表皮及真皮中的CXCR2表达水平 (为靶序列与 β 肌动蛋白序列吸光度之比 ,下同 )分别为 1 .2 9± 1 .1 3和 2 .4 2± 1 .2 6 ,明显高于皮损边缘部位及健康对照皮肤 (分别为 0 .5 2± 0 .4 6、0 .92± 0 .6 0和 0 .0 2± 0 .0 2、0 .0 5± 0 .0 4 ) (均P <0 .0 1 ) ,CXCR2基因表达在真皮高于表皮。结论 CXCR2可能参与银屑病的发病机制 ,建立的检测人体皮肤组织中趋化因子受体基因的RT

石榴花二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因RT-PCR扩增体系的建立与优化

分别以红花和粉花石榴‘泰山红’、‘重瓣粉花’盛花期花瓣为材料,提取RNA后进行反转录,对DFR基因的PCR扩增体系进行了优化,建立了高效、特异的石榴花DFR基因的RT-PCR扩增体系,为克隆基因全长奠定了基础。

应用RT-PCR快速检测病毒性心肌炎患者血清中CVB-RNA

目的：探讨ＲＴ－ＰＣＲ在病毒性心肌炎中的诊断价值。方法：选用柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＶＢ）保守区５′－非编码区的组特异性引物，对４２例临床拟诊为病毒性心肌炎的患者血清行ＲＴ－ＰＣＲ，以检测ＣＶＢ－ＲＮＡ，同时采用间接ＥＬＩＳＡ检测血清中ＣＶＢ－ＩｇＭ。结果：心肌炎患者血清中ＣＶＢ－ＲＮＡ的检出率为６６７％（２８／４２），而ＩｇＭ的检出率为５２４％（２２／４２）。结论：ＲＴ－ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ都是特异、敏感的诊断方法，并且ＲＴ－ＰＣＲ比ＥＬＩＳＡ敏感（Ｐ＜００５）

一种微型Pt温度传感器及其读出电路的研究

基于电阻温度系数(TCR)原理及微机电系统技术,设计并制作了一种用于微型聚合酶链式反应(PCR)芯片的Pt温度传感器及其读出电路。利用溅射和剥离技术将厚度为100 nm的弯曲条形Pt传感器制作在硅衬底上。其长度和宽度分别为2 030μm和10μm。设计了基于四线法温度测量的读出电路,该电路主要包括一个恒流源电路和一个电压放大电路。测试结果表明,该传感器的电阻温度系数为1.48×10-3℃-1,其电阻变化随着温度的变化具有良好的线性度,当温度在27～100℃变化时,电阻范围在653.5～716.5Ω变化。在接出一个8位的模数转换器以后,整个传感器和读出电路能确保一个精度为0.2℃的温度控制,满足一般PCR测量需要。

应用于微型PCR芯片的微加热器特性研究

设计制作了一种应用于微型聚合酶链式反应(PCR)芯片的微加热器。然后按照PCR循环温度的要求,利用该加热器进行了PCR温度实验。微加热器采用与MEMS工艺兼容的溅射方法在Si基上制作,微加热器材料为金属Pt。通过控制施加电压大小及时间,进行了变性温度、退火温度和延伸温度实验。结果表明:在25 V和32 V电压控制下的温升速度分别为0.68℃/s和1.23℃/s。在断电自然冷却下的降温速度均达到1℃/s。在一个PCR循环周期中每个反应仓的平均功耗为50 mW,最大功耗80 mW,整个10 mm×10 mm芯片的最大功耗为0.96 W。完成第一次PCR温度循环需要220 s,之后的每次循环仅需要175 s。

数字电视接收机减小PCR抖动影响的解决方法

PCR抖动一直都是工程应用中的难点,从数字电视接收端出发提出了减小由网络传输、多路复接与再复接引起的多种类型的PCR抖动影响的软件解决方案,具有很好的工程应用价值。

亚麻木质素合成关键酶基因表达分析

以亚麻(Linum usitatissimum)栽培品种白花为材料,采用半定量RT-PCR方法对亚麻木质素合成关键酶基因CCoAOMT1、4CL1、4CL2、COMT、F5H1、F5H2和F5H3在不同组织及不同时期木质部、韧皮部的表达规律进行了研究。结果显示,除F5H1在根部未表达外,其他基因在幼苗、根、花期木质部、花期韧皮部、叶、花和幼果中均有不同程度表达。CCoAOMT1在各部位都有较高的表达。2个4CL之间和3个F5H基因之间的部位表达的差异存在一定互补性。在韧皮部中,各基因均在幼嫩(30d)阶段表达量最低;除4CL2在花期(60d)达到表达高峰外,其他基因均在花后(70d)表达量最高;4CL1在各时期均有较强表达,而F5H3在各时期弱表达。在木质部中,除4CL1在各时期均表达弱和F5H1在花前期为表达高峰外,其余基因均在幼嫩阶段表达量最高;随后逐渐降低,在花期后表达量大幅降低;4CL1的表达量明显区别于其他基因,其各时期韧皮部的表达量明显高于木质部。

中国人杀菌蛋白氨基端基因的克隆和序列分析

本文报道中国人杀菌蛋白（BPI）氨基端基因CDNA的克隆及序列测定。采用逆转录PCR方法，分别从HL-60细胞和正常人外周血、HGVRNA阳性献血员外周血的淋巴细胞中克隆了人BPI氨基端基因BG60、BGNor和BGHGV。序列分析结果表明：BG60与文献报道一致：BGNor有3个核苷酸差异，推导有1个氨基酸变化；BGHGV有3个核苷酸差异，其中一处与BGNor相同，推导有2个氨基酸变化。由此推测中国人BPI氨基端基因可能具有特殊性。

导致氨基糖苷类药物双圈耐药型鲍曼不动杆菌的相关携带基因研究

目的探讨在K-B法药物敏感试验中对氨基糖苷类抗菌药物双圈耐药的鲍曼不动杆菌耐药基因携带状况及药物诱导对耐药基因mRNA表达量的影响。方法收集42株携带Ⅰ类整合子酶基因的鲍曼不动杆菌;PCR法扩增其整合子可变区;联合RFLP和DNA测序技术分析可变区耐药基因;用RT-PCR的方法分析药物诱导前后细菌耐药基因表达量。结果 90.4%(38/42)的整合子阳性菌株可变区扩增片段大小为2300bp左右。RFLP分型和DNA测序结果表明,整合子可变区携带的基因盒为aacA4-catB-aadA1。RT-PCR结果显示经阿米卡星诱导后细菌aacA4基因mRNA表达量显著上升。结论氨基糖苷类药物双圈耐药型菌株的Ⅰ类整合子中主要携带氨基糖苷类耐药基因,双圈现象可能与整合子携带的耐药基因诱导型表达有关。

胃癌组织中EB病毒的检测及其增殖期基因的表达

目的 :探讨EB病毒 (Epstein Barrvirus ,EBV)感染与胃癌发生的关系及其增殖期基因在EBV阳性胃癌发生中的作用。方法 :应用聚合酶链反应 (PCR) Southern杂交检测 185例胃癌组织和相应癌旁组织中特异性EBVDNA片段 ,PCR阳性标本用原位杂交 (ISH)技术检测石蜡切片组织中EBV编码小RNA 1(EBER1)的表达 ,以确定EBV阳性胃癌。再应用RT PCR和Southern杂交技术检测EBV增殖期基因 (即刻早期基因BZLF1、BRLF1,早期基因BARF1、BHRF1,晚期基因BcLF1、BLLF1)的表达。结果 :13例胃癌组织EBV阳性 (7.0 3% ) ,癌旁组织未检测到EBV感染 ,胃癌和癌旁组织中EBV阳性率有显著性差异 (χ2 =11.0 76 9,P =0 .0 0 0 9)。EBV阳性和阴性胃癌在年龄、病理类型、临床分期、淋巴结转移和发生部位的差别均无显著性 (P =0 .973,0 .14 1,0 .2 5 9,0 .5 86 ,0 .0 6 2 ) ,但性别之间的差异有显著性 ,男性EBV阳性率高于女性 (χ2 =5 .2 317,P =0 .0 2 1)。增殖期基因中即刻早期基因BZLF1有 6例表达阳性 ,而BRLF1均为阴性 ;早期基因中有 6例BARF1表达阳性 ,2例BHRF1表达阳性 ;晚期基因BcLF1有 7例表达阳性 ,而BLLF1均为阴性。结论 :EBV感染与胃癌的发生有一定的相关性 ,部分EBV阳性胃癌组织中存在EBV增殖性感染 ,早期基因BARF1和BHRF1在EBV阳?

Fas/FasL mRNA在小细胞肺癌石蜡包埋组织中的表达及其临床意义

目的探讨Fas、FasLmRNA在小细胞肺癌石蜡包埋组织中的表达情况及其临床意义。方法应用RT-PCR方法检测Fas、FasLmRNA在46例小细胞肺癌和相应的癌旁正常肺组织中的表达情况。结果46例小细胞肺癌中FasmRNA阳性表达率为47.8%,明显低于在正常肺组织中的表达率(80.0%)P<0.05,FasLmRNA阳性表达率为58.7%,明显高于在正常肺组织中的表达率(35%)P<0.05,FasLmRNA在淋巴结转移和TNM分期中的表达差异有统计学意义,FasLmRNA表达阳性组患者累计生存率明显低于阴性组患者。结论FasmRNA低表达可能对SCLC发展起促进作用;FasLmRNA高表达可能与SCLC转移和预后相关。

家蝇二氯苯醚菊酯抗性机理的初步研究

为了研究家蝇拟除虫菊酯抗性机理,在实验室选育了家蝇二氯苯醚菊酯抗性品系,根据P450基因CYP6D1的保守序列设计合成引物,用PCR方法从敏感品系和抗性品系个体都能扩增出一条约210bp的特异性片段,从片段大小和条带明亮程度上均未显示出二者之间有什么差异,初步表明抗性家蝇P450基因在DNA水平上没有明显的变化。RT-PCR结果多次重复显示抗性品系的扩增带明显比敏感品系的亮,揭示二者RNA的含量可能不同,抗性品系P450基因的转录活性可能升高。这些为在分子水平研究P450基因相关的拟除虫菊酯抗性机理打下基础。

大鼠Ⅲ度烧伤混合植皮愈合时生长因子mRNA表达的研究

目的：为了探索大面积Ⅲ度烧伤混合植皮创面愈合过程中生长因子的作用。方法：本实验以大鼠为模型，在异体皮移植后３、５、７、１４、２１和２８天以及自体皮移植后２、４、１１、１８和２５天分别取自体皮区、异体皮区皮肤，用酸性硫氰酸胍苯酚氯仿（ＡＧＰＣ）法提取总ＲＮＡ，经逆转录聚合酶链反应（ＰＴＰＣＲ），测定ＴＧＦα、ＴＧＦβ１、ＰＤＧＦ和ｂＦＧＦ的ｍＲＮＡ表达量。结果：１）这四种生长因子ｍＲＮＡ表达在自体皮区及异体皮区各时相都能被检测到，并且自体皮区表达均高于异体皮区。２）在自体皮区，ＴＧＦα的表达在２大以后持续升高，表达峰值在１８天；ＴＧＦβ１在２天就有高表达，第二峰值出现在１８天；ＰＤＧＦ在２天有较高表达，表达峰值在４天，随后逐渐下降，２５天回升：ｂＦＧＦ也在２天有很高表达，以后下降，象ＰＤＧＦ一样，２５天回升。３）在异体皮区，创面愈合早期这四种生长因子表达都较低，以后各有不同程度升高。结论：１）移植的自体皮与异体皮都存活，并反映了自体皮区的愈合再生较异体皮区旺盛。２）在自体皮区这四种生长因子通过自分泌作用，旁分泌作用，到达创伤区，沿着信号转导通路，相互协同发挥效应，促进创面愈合。３）在异体皮区存在排异反应，?

SERK基因片段在平邑甜茶和四倍性后代花期前后的表达特性研究

为了探索SERK基因在苹果属植物无融合生殖习性上的功能与作用,阐明该基因在胚胎发育早期在子房或胚珠组织的表达特性,以平邑甜茶及其与扎矮山定子杂交所得四倍性矮生后代28#和33#花期前后的子房中段为试材提取总RNA;利用通过平邑甜茶叶片中扩增并测序的SERK基因片段设计的特异引物,在以18S rRNA为内参基础上,采用RT-PCR技术分析了已得SERK基因片段在3份试材花期前后的表达情况。半定量RT-PCR分析结果表明,再次获得的SERK基因片段在3份试材胚胎发育的不同阶段均有表达,但表达强度有所不同。文中讨论了SERK基因片段的表达特性与胚胎发育和无融合生殖特征的关系。

传染性支气管炎病毒山东及北京分离株血清型及RFLP基因分型的比较研究

分离并鉴定出山东省不同地区的 IBV分离株 A、B、C、D和北京分离株 F,利用中和试验分别对各分离株及标准株M4 1 、T等进行血清分型。设计一对引物 ,分别对各毒株的 S1 基因进行 RT- PCR扩增 ,扩增片段长约 170 0 bp,利用其 PCR产物进行 Hae 酶切 ,根据酶切图谱 ,进行基因分型。结果表明 :A、C、D和 M4 1 酶切图谱相同 ,属 Mass基因型 ,分别为 90 0、4 0 0和30 0 bp左右的片段 ;北京 F株有 4条酶切条带 ,与 4 /91基因型不同 ,分别为 10 0 0、30 0、2 0 0和小于 10 0 bp左右的片段 ;B株有4条酶切条带 ,理论推断与 T株相似 ,分别为 70 0、5 0 0、30 0和 180 bp左右的片段 ,可能为同一基因型。血清学分型结果与基因分型结果不符。

新型冠状病毒不同核酸检测方法在临床应用中的评价

目的探讨和评价新型冠状病毒(SARS-CoV-2)不同核酸检测方法在临床工作中的应用。方法对2020年2月中旬送检的76例咽拭子标本及5例痰标本同时分别用一步RT-PCR法及NASBA(nuclear acid sequence-based amplification)恒温扩增芯片法进行2019-nCoV核酸检测。结果81例患者中确诊COVID-19的有51例,实时荧光一步RT-PCR法检测阳性21例(25.93%),NASBA恒温扩增芯片法检测阳性11例(13.58%)。实时荧光一步RT-PCR法在诊断COVID-19中灵敏度(0.412)高于NASBA恒温扩增芯片法(0.216),阴性预测值(0.500)高于恒温扩增法(0.429),诊断准确性(YI=0.412)高于恒温扩增芯片法(YI=0.216),两种方法的特异性和阳性预测值均为100%。两种方法单次检测的假阴性率分别为58.82%和78.43%。结论新型冠状病毒(SARS-CoV-2)不同核酸检测方法之间灵敏度差异较大,应用前要对检测方法和试剂盒进行性能评价,两种核酸检测法的特异性和阳性预测值均很高,但单次核酸检测结果假阴性率较高,临床诊断时应综合考虑。

鸡新城疫病毒新乡株ND-XX10的分离与鉴定

2010年初,已免疫过新城疫疫苗的新乡市某鸡场蛋鸡出现以消化道、呼吸道出血为主要症状的疑似新城疫病例。将病料经10日龄SPF鸡胚增殖分离病毒,命名为ND-XX10。提取其病毒基因组RNA,并以此为模板,RT-PCR扩增获得F基因主要功能区(1～631bp)片段并进行测序。结果显示,ND-XX10毒株F蛋白的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,是典型强毒株氨基酸序列结构,第101位和121位氨基酸残基分别是K(赖氨酸)和V(缬氨酸),通过基因进化树分析,确定此分离毒株属于基因Ⅶe型。