PTD-FNK蛋白的原核表达及纯化鉴定

【目的】原核表达Bcl-x L蛋白的突变体PTD-FNK蛋白,为揭示PTD-FNK蛋白的抗凋亡机制及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用提供参考依据。【方法】根据FNK蛋白核苷酸序列设计两对突变引物,以p ET-28a(+)-PTD-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增两段突变序列;回收PCR产物片段进行Dpn I消化,构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α,以IPTG诱导融合蛋白表达,探索IPTG诱导表达的适宜温度,最后以SDS-PAGE电泳和Western bloting对纯化蛋白进行鉴定。【结果】两个突变片段的PCR扩增产物大小分别为462和5616 bp,经Dpn I消化后进行重组反应,再转化至大肠杆菌DH5α能成功构建p ET-28a(+)-PTD-FNK质粒。在30℃下以IPTG诱导7 h可获得可溶性的PTD-FNK蛋白,以NI-NTA Argrose纯化后的融合蛋白经Western blotting鉴定为PTD-FNK蛋白。【结论】通过调控IPTG诱导温度可成功以可溶性形式表达出PTD-FNK蛋白,且诱导时间短,无须复性,有利于蛋白纯化及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用。

Bcl-xL及PTD-FNK蛋白的细胞保护作用研究进展

作者首先简述了Bcl-2蛋白家族成员Bcl-xL蛋白的结构与功能,Bcl-xL蛋白是体内重要的抗凋亡蛋白,其头部折叠结构完全符合Bcl-2家族蛋白结构模型,对多种细胞具有保护作用;其次介绍了Bcl-xL蛋白的功能增强型突变体PTD-FNK蛋白的生物学特性、功能、作用机制及临床应用情况,其对体内外细胞的穿透能力很强,可能通过抑制细胞线粒体途径的凋亡对不同类型细胞受到的多种损伤刺激产生良好的防御作用,这种组织细胞保护作用目前已经在临床治疗上被广泛应用。目前两种蛋白批量生产及实践应用的难点是其原核表达形式为包涵体,需要经过复杂的复性过程才能获取可溶性蛋白,且蛋白在复性过程中损耗极大。通过探索诱导两种蛋白表达的最优条件,大量诱导蛋白的可溶性表达并且进行纯化是今后研究工作的重点和方向,可为更好地推进其在组织细胞常温、低温、冷冻保存及医学临床中的应用奠定基础。

PTD-FNK蛋白影响猪睾丸支持细胞抗热应激能力的转录组学分析

旨在通过转录组测序和生物信息学分析评价PTD-FNK蛋白对猪睾丸支持细胞抵抗热应激能力的作用机制。将原代培养的睾丸支持细胞分为对照组、热应激(HS)组和热应激+PTD-FNK蛋白(HS+PR)组,HS+PR组添加0.1 nmol/L的PTD-FNK蛋白溶液作用1 h,对照组和HS组分别用等体积的PBS作用1 h,而后HS组和HS+PR组43℃热处理1 h,对照组37℃处理1 h。分别提取3组细胞总RNA,通过转录组测序进行分析,共获得76.75 Gb的有效数据(clean reads),各样品有效数据均达到7.11 Gb以上,测序质量较好。对照组与HS组相比共有270个差异表达基因(DEGs),其中上调基因193个,下调基因77个;HS组与HS+PR组相比共有3649个DEGs,其中上调基因1430个,下调基因2219个。基因本体(GO)注释结果显示,对照组与HS组相比以及HS组与HS+PR组相比,DEGs主要富集在细胞过程、细胞成分、结合、生物调节、代谢过程上,京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路主要富集在磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路以及癌症通路等。综合基因表达水平的分析,挖掘到包括分化抑制剂3(ID3)、组蛋白2A变异体(H2AX)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C)、肿瘤抑制蛋白p53(TP53)、诱导DNA损伤的转录因子3(DDIT3)、重组酶(RAD51)等调控细胞增殖与凋亡的DEGs。本研究为分析PTD-FNK蛋白的作用提供了新的参考和理论依据。

PTD-FNK蛋白对雄性小鼠生理功能的影响

[目的]探究PTD-FNK蛋白对雄性小鼠生理功能的影响。[方法]将16只8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组(n=8)和PTD-FNK蛋白组(n=8),对照组腹腔注射生理盐水,PTD-FNK蛋白组腹腔注射300μg/(kg·BW)PTD-FNK蛋白,每天腹腔注射给药1次,连续给药7 d;给药期间每天记录小鼠的体重、体温、血糖、采食量、饮水量,计算试验期间总采食量、总饮水量、体增重;于试验第1天和最后1天测量鼻肛距,计算试验前后Lee′s指数;试验结束立即处死小鼠,称量心脏、肾脏、肝脏、脾脏和睾丸重量,计算脏器指数;分离小鼠附睾,制备精子悬液,测定精子活力和质膜完整率;利用qPCR法检测睾丸组织中细胞凋亡相关基因Bax和Caspase-3、氧化应激相关基因SOD和GPX1、内分泌相关基因STAR、17β-HSD的mRNA相对表达量。[结果]与对照组相比,PTD-FNK蛋白组小鼠总采食量极显著(P<0.001)下降,总饮水量显著(P<0.05)下降;Lee′s指数、体温、体重、血糖无显著(P>0.05)变化。肝脏指数显著(P<0.05)下降,其他脏器指数无显著(P>0.05)变化。精子活力极显著(P<0.01)升高,精子质膜完整率无显著(P>0.05)变化。睾丸组织中Bax基因mRNA相对表达量极显著(P<0.01)升高,Caspase-3基因mRNA相对表达量无显著(P>0.05)变化,SOD基因mRNA相对表达量极显著(P<0.01)升高,GPX1基因mRNA相对表达量无显著(P>0.05)变化,17β-HSD、STAR基因的mRNA相对表达量无显著(P>0.05)变化。[结论]PTD-FNK蛋白可以抑制雄性小鼠的采食、饮水及肝脏的生长发育,提高小鼠的精子质量。

PTD-FNK蛋白对水牛精子的冷冻保护作用

PTD-FNK蛋白可以穿透细胞膜进入细胞内发挥抗凋亡作用,抵抗各种不利因素造成的细胞死亡,但国内未见将其加入水牛精液稀释液抑制精子冷冻凋亡的报道。本试验中,在水牛精液冷冻稀释液中添加不同浓度(0、0.1、1、10、100 nmol/L)的PTD-FNK蛋白,冻后检测精子常规质量指标的同时检测精子凋亡相关基因(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因)mRNA表达和Caspase-3蛋白酶的活性;最后以最优PTD-FNK蛋白浓度批量生产冷冻精液,选择50头广西地方母水牛进行人工授精试验。结果显示:①1 nmol/L组精子质膜完整性和10 nmol/L组精子活力显著高于对照组(P<0.05),1 nmol/L组精子活力和1、10 nmol/L组精子活率极显著高于对照组(P<0.01),而100 nmol/L组精子活率却极显著低于对照组(P<0.01);②1 nmol/L PTD-FNK蛋白显著降低冻后精子Caspase-3 mRNA表达(P<0.05);③人工授精后第60天受胎率达60%,略高于其他研究者取得的受胎率(56.25%,P>0.05)。总之,PTD-FNK蛋白可以显著提高水牛精子冻后质量,其机制之一可能是它显著抑制了冻后精子Caspase-3 mRNA的表达;以PTD-FNK蛋白冷冻的水牛精液实施人工授精后可以取得比现有水平更高的受胎率。

细胞保护蛋白PTD-FNK生物信息学分析

PTD-FNK蛋白是人工形成的重组蛋白质,已被证明在细胞凋亡、精子冷冻保存过程中对细胞有一定的保护作用,虽然在实践中应用普遍,但国内未见其机理分析和通过蛋白结合参与调控的报道。结合Protparam、ProtScale等相关在线软件预测和分析PTD-FNK蛋白的理化性质、亲水性、二、三级结构等;分离培养猪睾丸支持细胞,采用HISpulldown技术拉下PTD-FNK未知的互作蛋白,得到的数据用UniProt数据库对比。生物信息学结果表明,PTDFNK蛋白编码295个氨基酸,蛋白质分子量33.195ku,分子式为C_(1456)H_(2225)N_(437)O_(439)S_(10);该蛋白含有PKC、PKA特异性磷酸化的结合位点。得到的互作蛋白有葡萄糖调节蛋白78、波形蛋白-1、组蛋白等。预测PTD-FNK蛋白可能通过PKA、PKC特异性磷酸化结合位点或者与蛋白互作的方式参与细胞凋亡、精子发生等过程。

细胞保护蛋白PTD-FNK对脂多糖诱导的小鼠睾丸炎性损伤的保护作用

本试验旨在探索细胞保护蛋白PTD-FNK对脂多糖诱导的小鼠睾丸炎性损伤的作用机制。将30只C57BL/6J雄性小鼠随机分为空白组、LPS组(20 mg/kg)、LPS+PTD-FNK(0.1、0.3、0.5 mg/kg)组。空白组腹腔注射0.9%生理盐水,LPS组腹腔注射含LPS(20 mg/kg)的生理盐水,LPS+PTD-FNK组先腹腔注射含有不同浓度PTD-FNK的生理盐水预保护1 h,再以20 mg/kg的LPS腹腔注射诱导其睾丸炎症6 h,随后颈椎脱位处死,分别取各组小鼠睾丸用于后续试验。HE染色观察小鼠睾丸组织形态结构变化,Western-blot检测睾丸细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测睾酮分泌水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测小鼠睾酮合成相关基因(STAR、CYP11A1、17β-HSD、3β-HSD)、炎症因子相关基因(IL-6、IL-1β、TNF-α)及血睾屏障(BTB)相关基因(CX-43、ZO-1、Occludin)mRNA的表达。结果显示,与LPS组相比,LPS+PTD-FNK组小鼠睾丸病理损伤得到明显改善;IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA的表达显著降低,CYP11A1、17β-HSD、3β-HSD、CX-43、ZO-1、Occludin mRNA的表达显著升高;小鼠睾酮分泌水平显著提高,焦亡蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β的表达显著下降。结果表明,0.3 mg/kg的PTD-FNK可在一定程度上缓解小鼠睾丸炎性损伤,降低睾丸细胞焦亡,增强血睾屏障功能以及提高小鼠睾酮合成与分泌能力。