PTD-p53融合蛋白的表达、纯化及其对肝癌细胞的转导活性

目的:原核表达野生型p53与PTD的融合蛋白,检测PTD介导p53进入肝癌细胞的效率。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTATHA和pET32 a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将PTD-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测PTD-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了p53融合蛋白及p53蛋白,证实PTD-p53可以高效地转入HepG2细胞。结论:PTD-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用PTD-p53蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。

PTD-p53融合蛋白调控肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的研究

目的探究PTD-p53融合蛋白进入肝癌细胞,调控HepG2细胞增殖与凋亡的生物学功能。方法构建pET28a-PTD-p53原核重组载体,表达具有进入细胞能力的PTD-p53融合蛋白。SDS-PAGE电泳检测融合蛋白质量分数和特异性;蛋白质印迹技术检测融合蛋白跨膜能力;细胞形态学观察和流式细胞仪分析PTD-p53融合蛋白对肝癌细胞HepG2凋亡水平的影响;细胞克隆实验探讨PTD-p53融合蛋白对HepG2细胞的增殖调控。结果大肠杆菌表达的PTD-p53融合蛋白主要位于包涵体中,复性后的PTD-p53能够以浓度梯度方式进入HepG2细胞,细胞形态学观察和流式细胞仪检测结果表明,PTD-p53融合蛋白处理促进HepG2细胞凋亡;细胞克隆实验显示终质量浓度为1 mg/L或2.5 mg/L的PTD-p53处理HepG2细胞,以剂量依赖方式抑制HepG2细胞克隆形成。结论PTD-p53融合蛋白可以进入肝癌细胞,促进HepG2细胞凋亡,抑制细胞增殖,为进一步体内验证PTD-p53融合蛋白抑制肿瘤的效果奠定基础。

MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白原核表达载体的构建与蛋白制备

目的:采用分子克隆技术和大肠杆菌原核表达系统制备具备生物学活性MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白。方法:首先应用PCR合成大肠杆菌硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)A的c DNA序列,将其插入到大肠杆菌原核表达载体p ET40b中,将人工合成的人免疫缺陷病毒(human immuno-deficiency virus,HIV-1)反式激活蛋白(transactivator,TAT)的蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)和MDM2/4双抑制肽p DI(peptide double inhibition)的c DNA序列分别插入到Trx序列的C端和核心位点,从而构建出可表达MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白的原核表达载体p ET-TAT-Trx A-p DI。然后将p ET-TAT-Trx A-p DI原核表达载体转化大肠杆菌表达菌种BL21感受态细胞,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导蛋白表达,筛选最优表达的单克隆菌种,分析重组蛋白的表达部位,并了解不同IPTG浓度(0.1mmol/L、0.4mmol/L、0.7mmol/L、1.0mmol/L)、温度(16℃、25℃、37℃)、表达诱导时间(1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h)对MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白表达的影响,以获得最优的蛋白表达条件。最终利用MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白携带的His标签,采用能够特异性结合His标签的蛋白纯化柱进行蛋白纯化,并应用梯度透析法和氧化还原法进行MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白的体外折叠。结果:成功构建可以表达MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白的原核表达载体p ET-TAT-Trx A-p DI,并实现MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白在大肠杆菌表达菌种BL21(DE3)中的高效表达,表达量占总蛋白表达量的60%以上,并且主要存在于包涵体中。蛋白表达条件优化结果发现,温度对重组蛋白表达无明显影响,而应用0.4mmol/L的IPTG浓度和3h的诱导时间即可获得重组蛋白的高效表达。经过蛋白纯化后获得纯度99.99%的重组蛋白,将纯化的MDM2/MDM4双靶点抑制蛋白溶液用梯度透析复性和氧化还原复性法最终成功获得包涵体蛋白的体外正确折叠,复性效率约为80%。结论:成功实现MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白在大肠杆菌原核表达系统中的高效表达、纯化以及体外的正确折叠,最终获得高纯度并具有生物学活性的MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白,从而为进一步MDM2/4-p53双靶点抑制蛋白抗肿瘤活性与机制的研究奠定了基础。

重组人P53融合蛋白抗肝癌细胞的实验研究

研究蛋白传导域(PTD)与人野生型P53(W tP53)融合表达的P53融合蛋白PTD-P53对HepG2的增殖抑制和凋亡的影响。用PTD-P53处理HepG2后,采用MTT法分析处理后细胞的生长增殖情况,流式细胞术(FCM)分析处理后细胞周期变化及脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况。PTD-P53对HepG2的生长有明显抑制作用。细胞周期也出现阻滞现象,细胞凋亡明显增加。PTD-P53有一定的抗肝癌细胞作用。