PTD4-Apoptin融合蛋白可溶性表达及其对Hela细胞的抑制作用

目的构建PTD4-Apoptin融合蛋白的原核表达载体并表达蛋白,检测其对Hela细胞的生长抑制作用。方法人工合成Apoptin序列和PTD4序列,构建p GEX-6p-1-PTD4-Apoptin原核表达载体,使其在E.coli BL21(DE3)中表达。使用GST亲和层析柱纯化融合蛋白,并使用超滤管浓缩纯化后的目的蛋白,得到高浓度的融合蛋白。向Hela细胞中加入融合蛋白,检测其对Hela细胞的生长抑制作用。结果 PTD4-Apoptin融合蛋白在大肠杆菌中可溶性表达成功,对Hela细胞生长具有抑制作用,PTD4-Apoptin对Hela细胞抑制率达82.34%。结论成功构建PTD4-Apoptin融合蛋白表达载体,并表达可溶性的融合蛋白,PTD4-Apoptin对Hela细胞具有明显的抑制作用。

PTD4-凋亡素融合蛋白对Hela细胞bak基因表达的影响

目的研究PTD4-凋亡素(apoptin)融合蛋白对Hela细胞bak基因表达的影响。方法原核表达系统表达PTD4-apoptin融合蛋白,使用CCK8试剂盒检测融合蛋白对Hela细胞的抑制作用;PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela细胞24 h后,提取细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western印迹检测bak基因在RNA水平和蛋白水平的表达。结果 PTD4-apoptin融合蛋白诱导Hela细胞bak mRNA和蛋白水平表达量较对照组均显著提高。结论 PTD4-apoptin蛋白可诱导Hela细胞凋亡,与bak基因参与凋亡调控相关。

PTD4-GFP-VP3融合蛋白在人肝癌细胞HepG_2中的定位观察及凋亡诱导效应的实验研究

目的观测PTD4-GFP-VP3融合蛋白诱导人肝癌细胞HepG_2的凋亡效应及其在肿瘤细胞中的定位与其凋亡效应关系的研究。方法构建PTD4-GFP-VP3融合蛋白的原核表达载体,利用人源肝癌细胞株HepG_2,经细胞透膜实验在激光共聚焦显微镜下观察PTD4介导的融合蛋白透膜效应,DAPI染色观测该蛋白在细胞中的定位;利用TUNEL法观察PTIM-GFP-VP3融合蛋白诱导肿瘤细胞的凋亡效应,并利用流式细胞仪检测其凋亡率。结果PTD4-GFP-VP3融合蛋白在孵育细胞0.5h后即可透过细胞膜进入到细胞质中,12h后定位于细胞核并诱导肿瘤细胞凋亡,48h达到最高凋亡效应。结论PTD4能携带GFP-VP3融合蛋白穿透细胞膜,在肿瘤细胞中具有核定位效应,并能诱导肿瘤细胞凋亡,为后期进一步研究VP3的凋亡机制及其抗肿瘤治疗奠定了基础。

BALB/c小鼠宫颈癌原位瘤模型的建立与治疗

目的:通过建立BALB/c小鼠原位瘤模型,模拟临床肿瘤环境,为观察PTD4-apoptin融合蛋白的抗肿瘤效应提供实验基础。方法:采用两种方法建立BALB/c小鼠宫颈癌原位瘤模型,以PTD4-apoptin融合蛋白进行21天的短期治疗。TUNEL检测PTD4-apoptin融合蛋白的促凋亡效应,HE染色评估肿瘤的形态学变化。结果:与异体异位宫颈癌组织移植法相比,宫颈注射U14宫颈癌细胞悬液的成瘤效果更好。原位瘤给予PTD4-apoptin融合蛋白可显著抑制肿瘤生长,促进肿瘤细胞的凋亡。结论:小鼠宫颈注射U14宫颈癌细胞悬液可建立宫颈癌原位瘤模型,PTD4-apoptin融合蛋白可抑制该原位癌。

SOD融合蛋白外用对皮肤自然老化的影响

目的探究皮肤外用PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白(简称SOD融合蛋白)在防治皮肤自然老化过程中的有效性及安全性。方法将SOD融合蛋白乳膏按乳膏中SOD活力浓度分为单乳(0 U/cm^(2))、乳膏A(100 U/cm^(2))、乳膏B(300 U/cm^(2))、乳膏C(900 U/cm^(2)),以单乳、乳膏C作小鼠去毛区皮肤外用干预,观察小鼠涂抹部位皮肤刺激性、致敏性及经皮毒性。健康6周龄昆明小鼠96只,随机分为6组,采用皮下注射D-半乳糖1000 mg/kg连续42 d建立小鼠亚急性衰老模型,空白对照组(N组)皮下注射等体积的生理盐水。除N组、模型对照组(M组),余4组空白基质组(BM组),低剂量组(LD组),中剂量组(MD组),高剂量组(HD组)涂抹单乳、乳膏A、B、C于小鼠背部脱毛区,封闭6 h后清除残余,连续28 d后,每组取8只小鼠处死,观察脱毛区皮肤组织结构、SOD活性、MDA浓度以及弹性蛋白与胶原蛋白Ⅰ含量的改变,余小鼠继续D-半乳糖干预至42 d,标本留取同上。采用SPSS23.0对实验数据进行分析。结果(1)外用安全性试验中,以900 U/cm^(2)活性浓度涂抹SOD融合蛋白乳膏,并未发现小鼠皮肤有红斑、水疱等致敏及刺激症状。经皮毒性试验中,涂抹单乳及乳膏C两组未出现小鼠死亡,且两组的血液学、血生化、脏器质量等指标差异无统计学意义(P>0.05)。(2)在自然老化试验中,与BM组相比,MD组、HD组小鼠皮毛浓密发亮、顺滑,皮肤结构清晰完整,真皮层明显增厚,且皮肤中MDA含量降低,SOD活力升高,真皮层弹性蛋白表达量增加(P<0.05)。结论SOD融合蛋白乳膏在以900 U/cm^(2)活性浓度涂抹下,具有较好的外用安全性。持续使用300 U/cm^(2)的SOD融合蛋白乳膏,可有效改善小鼠表皮变薄、真皮结缔组织排列紊乱、纤维断裂等问题,可为临床上与年龄相关的皮肤老化及疾病的防治提供新的方法。