黄芪甲苷靶向miR-21调控PTEN/AKT/mTOR通路激活肺泡细胞自噬治疗肺纤维化

目的探究黄芪甲苷-IV(Astragaloside IV,AS-IV)靶向miR-21调控PTEN/AKT/mTOR信号通路激活自噬,抑制特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)发展进程的作用机制。方法通过气管注射10 mg·kg^(-1)博莱霉素造模小鼠IPF,分别以10、20、40 mg·kg^(-1) AS-IV及5 mg·kg^(-1)醋酸泼尼松连续治疗28 d。对肺样本进行伊红美蓝,马松染色,及透射电镜观察。实时荧光定量法(qRT-PCR)或蛋白免疫印迹法(Western blot)检测样本中miR-21、P62、Beclin^(-1)、LC3B、PTEN、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR等的表达。结果醋酸泼尼松及40 mg·kg^(-1) AS-IV可显著减少肺纤维组织增生与炎性细胞浸润,抑制嗜锇性板层小体变性,促进肺泡上皮细胞中自噬体的形成,显著上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例与Beclin^(-1)、PTEN蛋白表达,下调P62、miR-21表达,并抑制mTOR与AKT的磷酸化。但AS-IV治疗对PI3K表达无明显影响。结论AS-IV通过靶向miR-21调控PTEN/AKT/mTOR信号通路激活,从而激活肺泡细胞自噬逆转IPF。

miR-181-5p靶向PTEN/AKT/mTOR通路对氧化应激诱导下人皮肤成纤维细胞自噬及老化的影响

目的探讨miR-181-5p靶向10号染色体上缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对氧化应激诱导下人皮肤成纤维(HDF)细胞自噬及老化的影响。方法以HDF细胞为研究对象,利用不同浓度H_(2)O_(2)(0、100、200、500μmol/L)处理细胞,通过CCK-8法检测细胞存活率,确定构建细胞老化模型的适宜H_(2)O_(2)浓度,并将该浓度H_(2)O_(2)诱导的HDF细胞命名为H_(2)O_(2)模型细胞;双荧光素酶报告基因实验验证miR-181-5p与PTEN的靶向关系;利用Lipofectamine2000试剂盒对H_(2)O_(2)模型细胞进行转染,细胞分组为:空白组(细胞未转染)、miR-181-5p mimics组、miR-NC组、anti-miR-181-5p组、anti-miR-NC组;荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中miR-181-5p表达水平;Western印迹检测细胞中PTEN/AKT/mTOR通路相关蛋白、自噬相关蛋白(Beclin)-1、微管相关蛋白轻链(LC)3Ⅱ/Ⅰ表达水平;β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)试剂盒观察各组细胞形态及SA-β-gal染色阳性比例。结果随着H_(2)O_(2)浓度的升高,HDF细胞存活率逐渐降低,有统计学差异(P<0.05),H_(2)O_(2)浓度为200μmol/L时,细胞存活率为51.64%,所以选择200μmol/L H_(2)O_(2)作为适宜诱导浓度;与HDF细胞相比,H_(2)O_(2)模型细胞中miR-181-5p、磷酸化(p)-AKT、p-mTOR蛋白表达明显上调,PTEN蛋白表达明显下调(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实PTEN和miR-181-5p存在靶向关系;与空白组和miR-NC组比较,miR-181-5p mimics组中miR-181-5p、p-AKT、p-mTOR蛋白表达明显上调,PTEN、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达明显下调(P<0.05),细胞排列不规则、变大,轮廓不清楚,折光性差等老化状态更加明显,SA-β-gal染色阳性率显著升高(P<0.05);与空白组和anti-miR-NC组比较,anti-miR-181-5p组中miR-181-5p、p-AKT、p-mTOR蛋白表达明显下调,PTEN、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达明显上调(P<0.05),大多数细胞呈长梭形,轮廓清晰,折光性好,且SA-β-gal染色阳性率显著降低(P<0.05)。结论抑制miR-181-5p可能通过靶向上调PTEN蛋白表达,抑制AKT/mTOR通路,促进细胞自噬,进而延缓氧化应激诱导下HDF细胞老化。

糖尿病大鼠肾组织中PTEN/AKT/mTOR通路对自噬的调控作用

目的:观察糖尿病大鼠肾组织中PTEN和自噬水平的变化,探讨糖尿病肾病中PTEN/AKT/m TOR通路对自噬的调控机制。方法:将SD大鼠随机分为正常对照组(NC组)和糖尿病组(DM组),每组各8只。用链脲佐菌素复制DM大鼠模型。于成模后10周处死大鼠后测定相应生化指标和肾脏指数,免疫组化观察肾小管上皮细胞PTEN蛋白的表达部位;Western blotting法检测肾组织LC3、PTEN及PTEN/AKT/m TOR通路的变化;realtime PCR检测肾组织PTEN的mRNA表达水平。结果:DM组的血糖、24 h尿蛋白量和肾脏指数均显著高于NC组(P<0.05)。与NC组相比,DM组大鼠肾组织的LC3I和LC3II水平明显降低(P<0.05)。PTEN主要分布于肾小管上皮细胞中,DM组PTEN蛋白的表达水平明显低于NC组(P<0.05)。DM大鼠肾组织中,PTEN/AKT/m TOR通路的活性增高。结论:糖尿病大鼠肾脏组织中细胞自噬水平下降,而参与自噬调控的PTEN/AKT/m TOR通路活性升高,提示其自噬水平的变化可能受到PTEN/AKT/m TOR通路的调节。

PTEN/Akt/mTOR通路增加K562/ADM细胞化疗敏感性

目的探讨K562/ADM细胞系中PTEN/Akt/mTOR信号通路对不同化疗药物敏感性的影响。方法 K562/ADM细胞分为未转染组、转染野生型PTEN组(Ad-PTEN-GFP)、转染空载体组(Ad-GFP),并与不同浓度雷帕霉素或三氧化二砷(As2O3)联合作用。通过MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率,荧光定量PCR检测PTEN、mTOR、BCL-2及BAX mRNA水平,Western blot检测PTEN及Akt、p-Akt蛋白水平。结果野生型PTEN对K562/ADM细胞最大增殖抑制率为32.3%,与未转染组及Ad-GFP组相比,Ad-PTEN-GFP组mTOR mRNA和p-Akt蛋白明显减低;雷帕霉素与As2O3联合应用后细胞增殖明显受抑,凋亡率(28.61%±1.46%)明显高于单药作用组(P<0.05),BCL-2 mRNA表达降低,BAX mRNA表达增加,以联合干预组最为明显。结论 PTEN/Akt/mTOR信号传导通路能够增加K562/ADM细胞对雷帕霉素及As2O3的敏感性。

血必净注射液通过PTEN/PI3K/Akt/mTOR信号通路对大鼠肺缺血再灌注损伤的影响

目的:探讨血必净注射液对肺缺血再灌注损伤的保护作用及其相关机制。方法:选择18只健康成年雄性大鼠,随机分为正常对照组(Sham组)、肺缺血再灌注组(LIR组)、血必净注射液组(XBJ组),采用开胸夹闭左肺门构建肺缺血再灌注损伤大鼠模型,苏木素—伊红染色观察各组大鼠肺组织病理学改变,检测各组大鼠肺组织湿/干重比(W/D)及肺组织炎症因子IL-1β、TNF-α水平,Western Blot检测各组肺组织PTEN、PI3K、Akt、mTOR、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62蛋白表达,qRT-PCR检测各组肺组织PTEN、PI3K、Akt、mTOR mRNA表达。结果:血必净注射液可显著减轻肺缺血再灌注大鼠肺组织损伤,降低缺血再灌注大鼠肺组织W/D及IL-1β、TNF-α含量(P<0.05)。与Sham组相比,LIR组、XBJ组PTEN、PI3K、Akt、mTOR、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62表达均升高(P<0.05);与LIR组相比,XBJ组PTEN、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62表达降低(P<0.05),PI3K、Akt、mTOR表达升高(P<0.05)。与Sham组相比,LIR组、XBJ组PTEN、PI3K、Akt、mTOR mRNA表达升高(P<0.05);与LIR组相比,XBJ组PTEN mRNA表达降低(P<0.05),PI3K、Akt、mTOR mRNA表达升高(P<0.05)。结论:血必净注射液可能通过抑制PTEN,激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制肺缺血再灌注损伤自噬水平,从而改善肺缺血再灌注损伤,达到保护肺组织的作用。

加味芪黄饮改善糖尿病肾病的PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路机制研究

目的:研究加味芪黄饮通过PTEN/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)通路改善糖尿病肾病(DN)的作用机制。方法:Sprague-Dawle(SD)大鼠利用高脂饲料饲养联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立DN模型,采用完全随机法分为模型组、加味芪黄饮低剂量组、中剂量组、高剂量组及氯沙坦组。各10只。根据临床用量换算,设定加味芪黄饮低剂量组、中剂量组、高剂量组[生药含量:200、400、800 mg·kg^(-1)·d^(-1)],空白组及模型组予0.9%氯化钠注射液灌胃。8周后取材,检测DN大鼠24 h尿蛋白、血肌酐(SCr)、血尿素氮水平(BUN),苏木精-伊红(HE)染色观察肾脏病理变化,免疫组化检测肾组织中PTEN、PI3K、Akt和mTOR等蛋白表达。结果:与空白组相比,模型组大鼠24 h尿蛋白、SCr、BUN水平显著升高(P<0.0001);加味芪黄饮干预后肾功能指标相比于模型组有所降低(P<0.001),免疫组化结果提示:模型组PTEN表达降低,PI3K、Akt、mTOR表达升高(P<0.01);加味芪黄饮干预后,PTEN表达量上升,PI3K、Akt及mTOR表达量下降,相比模型组差异均具有统计学意义(P<0.05)。加味芪黄饮高剂量组与氯沙坦组疗效差异无统计学意义(P>0.05)。结论:加味芪黄饮可能通过PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路延缓DN发展。

异莲心碱通过PI3K/Akt/mTOR信号通路影响结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬

目的:探讨异莲心碱(Iso)通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬的影响。方法:用10、20和40μmol/L的Iso处理结肠癌SW480细胞,CCK-8法、流式细胞术和WB法分别检测Iso对细胞增殖活力、凋亡和自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62表达的影响。然后,用20μmol/L的Iso和25μmol/L的PI3K激活剂740 Y-P分别处理SW480细胞,将细胞分为对照组、740 Y-P组、Iso组和Iso+740 Y-P组,流式细胞术、WB法检测Iso和740 Y-P对各组细胞凋亡及细胞中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、PI3K、p-PI3K、mTOR和p-mTOR蛋白表达的影响。结果:10、20和40μmol/L的Iso处理后,SW480细胞增殖活力均显著下降(均P<0.05),细胞凋亡率均显著升高(均P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著上调(均P<0.05),p26蛋白表达显著下调(P<0.05)。Iso和740 Y-P处理后,与对照组相比,740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05);Iso组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与740 Y-P组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与Iso组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05)。结论:Iso通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制结肠癌SW480细胞增殖并诱导细胞凋亡和自噬。

调补心肾方通过活化PI3K/Akt/mTOR通路促进阿尔茨海默病5xFAD转基因小鼠突触可塑性相关蛋白的合成

目的探讨调补心肾方(党参、制首乌、枸杞子、黄芪等)对阿尔茨海默病5xFAD转基因小鼠突触可塑性的影响及机制。方法取5月龄雄性野生型(WT)小鼠和5xFAD转基因小鼠各18只,分别随机分为对照组(0.9%NaCl)、调补心肾方组(颗粒剂,4.18 g·kg^(-1))、安理申组(盐酸多奈哌齐,0.625 mg·kg^(-1)),每组6只。按照上述分组灌胃给药,每日1次,共60 d。采用透射电镜观察小鼠海马组织超微结构;Western Blot法检测小鼠皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1、NMDAR1、p-CaMKⅡa、CaMKⅡa、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表达水平。结果与WT对照组比较,5xFAD对照组小鼠海马CA1区突触的超微结构不规则,线粒体萎缩、减少,线粒体嵴断裂、消失,突触膜弯曲不规则,突触囊泡减少,突触后致密物(PDS)变薄甚至断裂;皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1/NMDAR1、p-CaMKⅡa/CaMKⅡa、PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达均明显下调(P<0.05)。与5xFAD对照组相比较,5xFAD调补心肾方组小鼠海马CA1区突触的超微结构有明显变化,线粒体数量增加,突触囊泡增多,突触膜完整,突触后致密物有增厚现象;皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1/NMDAR1、p-CaMKⅡa/CaMKⅡa、PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论调补心肾方可能通过活化PI3K/Akt/mTOR通路,促进突触可塑性相关蛋白合成,进而改善AD的认知功能障碍。

栀子苷调节PI3K/AKT/mTOR信号通路在动脉粥样硬化形成过程中对Th17/Treg功能的影响

目的:观察栀子苷对载脂蛋白E缺乏(ApoE^(-/-))小鼠Th17/调节性T(Treg)细胞失衡的影响及其作用机制。方法:将50只纯合子ApoE^(-/-)雌性小鼠随机分为对照组、模型组和栀子苷低剂量组、栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组。对照组小鼠喂养普通饲料,模型组和栀子苷组小鼠喂养高脂饲料。从第8周开始,栀子苷各剂量组每日灌胃栀子苷(25、50、100 mg/kg),连续8周。试验结束时,采用油红O染色评估主动脉及其根部动脉粥样硬化(AS)病变面积比。采用定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析主动脉组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-17A和IL-10 mRNA表达;采用流式细胞仪分析脾脏中Th17和Treg细胞百分比;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测主动脉组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达。结果:油红O染色病变显示,栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组病变百分比低于模型组(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平升高(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平降低(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平升高(P<0.05)。与对照组比较,模型组小鼠脾脏中Th17细胞百分比升高,Treg细胞百分比降低(P<0.05)。栀子苷处理恢复了AS小鼠Th17和Treg细胞的平衡。栀子苷抑制PI3K的表达及AKT和mTOR的磷酸化,MHY1485(mTOR活化剂)减弱了栀子苷对T细胞分化的影响。结论:栀子苷抗AS作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号引起的Treg细胞增多和Th17细胞减少有关。

茯苓酸调控PI3K/AKT/mTOR通路介导葡萄糖代谢促进结直肠癌细胞凋亡的机制研究

目的 研究茯苓酸对结直肠癌细胞葡萄糖代谢及细胞凋亡的调控作用。方法 通过细胞活性测定(Cell Counting Kit-8,CCK8)、克隆形成等实验检测茯苓酸对结直肠癌细胞增殖与细胞活性的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞凋亡实验检测茯苓酸对结直肠癌细胞凋亡的影响;使用细胞氧气消耗率和细胞外酸化率测定仪器及细胞葡萄糖代谢水平测定试剂盒检测茯苓酸对结直肠癌细胞葡萄糖代谢的影响;通过蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)实验验证凋亡、糖酵解、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)/丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶(AKT Serine/Threonine Kinase 1,AKT)/雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)通路相关蛋白表达情况。结果 茯苓酸能够有效抑制结直肠癌细胞增殖与细胞活性,并能够通过抑制其糖酵解水平促进其细胞凋亡,同时显著抑制PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达水平。结论 茯苓酸可通过调控PI3K/AKT/mTOR通路介导葡萄糖代谢促进CRC细胞凋亡,可作为未来结直肠癌代谢靶向治疗的潜在药物。

彝药痹Ⅱ号介导KLF2调控PI3K/Akt/mTOR通路对类风湿性关节炎小鼠模型表达及生物学行为特性影响的机制研究

目的:探讨彝药痹Ⅱ号介导KLF2调控PI3K/Akt/mTOR通路对类风湿性关节炎小鼠模型表达及生物学行为特性影响的机制。方法:80只昆明种小鼠分为对照组、模型组、彝药痹Ⅱ号组低、高剂量组;除对照组外,其余各组通过左后足趾皮内注射弗氏完全佐剂建立小鼠RA模型;彝药痹Ⅱ号组低、高剂量组于造模成功第1天开始给予相应剂量药物灌胃,持续给予3个月,对照组和模型组给予等体积生理盐水。试验结束后测定小鼠PEL、关节炎症积分、足趾容积;RT-PCR法、蛋白印迹法、免疫组化法测定小鼠踝关节软骨KLF2、PI3K、Akt、mTOR水平。结果:模型组小鼠PEL低于对照组,关节炎症积分、足趾容积高于对照组(P<0.05);彝药痹Ⅱ号低、高剂量组小鼠PEL高于对照组,关节炎症积分、足趾容积低于对照组(P<0.05);且随着彝药痹Ⅱ号剂量的逐渐升高,各剂量组小鼠PEL逐渐升高,关节炎症积分、足趾容积逐渐降低(P<0.05)。模型组小鼠踝关节KLF2、PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白表达水平高于对照组(P<0.05);与模型组比较,彝药痹Ⅱ号低、高剂量组小鼠踝关节KLF2、PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白表达水平低于对照组(P<0.05);且随着彝药痹Ⅱ号剂量的逐渐升高,各剂量组小鼠踝关节KLF2、PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。结论:彝药痹Ⅱ号对小鼠类风湿性关节炎具有明显治疗作用,能明显抑制小鼠踝关节软骨滑膜炎症反应;其机制与彝药痹Ⅱ号抑制类风湿性关节炎小鼠踝关节软骨炎症KLF2-PI3K-Akt-mTOR通路的激活有关。

基于Akt/mTOR信号通路探讨补肾活血方对去卵巢大鼠软骨细胞自噬的影响

目的:研究补肾活血方是否可以通过调控Akt/mTOR信号通路促进去卵巢大鼠软骨细胞自噬反应来保护关节软骨。方法:选取30只SPF级12周龄雌性SD大鼠,体重(247.0±7.0)g,先随机选择6只为空白对照组,剩余大鼠采用卵巢切除术结合右膝关节腔注射碘乙酸钠(monosodium iodoacetate,MIA)建立绝经后膝骨关节炎模型,随机分为模型组、BSHXR-L组、BSHXR-M组、BSHXR-H组,每组6只。运用肉眼观察评分、番红O-固绿染色、免疫组化等方法明确补肾活血方对大鼠关节软骨损伤的保护作用,Western-blot检测自噬相关蛋白的表达,qPCR检测Akt、mTOR及下游自噬基因的相对表达。结果:造模后BSHXR(L、M、H)各组均可减轻软骨组织形态学损伤,免疫组化示Collagen-Ⅱ、Aggrecan表达逐渐升高,基质金属蛋白酶-13(matrix metallopriteinase-13,MMP-13)表达逐渐降低,其中BSHXR-M组和BSHXR-H组与模型组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。Western-blot结果示BSHXR(L、M、H)各组自噬通路蛋白p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR受到抑制,下游蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ表达逐渐升高,而p62逐渐降低,呈剂量效应。qPCR结果示BSHXR(L、M、H)各组均可促进Beclin-1、LC3ⅡmRNA的相对表达,抑制p62、Akt、mTOR mRNA的相对表达,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:补肾活血方可以通过抑制Akt/mTOR信号通路增强软骨细胞自噬反应,进而发挥保护软骨的作用。

布比卡因通过PI3K/AKT/mTOR通路对膀胱癌细胞凋亡和铁死亡的影响

目的 探讨布比卡因对膀胱癌细胞凋亡和铁死亡的影响及其机制。方法 常规培养人膀胱癌细胞(T24和5637)和人尿路上皮细胞(SV-HUC-1),MTT实验检测布比卡因细胞毒性,筛选合适处理浓度,将T24和5637细胞分为对照组、0.25、0.5和1 mmol/L布比卡因组、布比卡因+铁死亡激动剂(Erastin)组、布比卡因+铁死亡抑制剂(Fer-1)组细胞和布比卡因+PI3K激动剂(740Y-P)组。采用流式细胞术检测细胞凋亡率,相应试剂盒检测Fe^(2+)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平,Western blot检测Bcl-2、Bax、细胞色素C、xCT、GPX4和磷脂酰肌醇3/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)相关蛋白表达。结果 0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol/L布比卡因均可明显抑制T24和5637细胞的活性(P<0.001),选择仅对癌细胞有毒性的0.25、0.5和1 mmol/L布比卡因进行后续研究。与对照组比较,随着布比卡因浓度增加,T24和5637细胞凋亡率、Fe^(2+)、ROS和MDA水平逐渐升高,GSH水平逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.001);与1 mmol/L布比卡因组比较,布比卡因+Erastin组Fe^(2+)水平升高,而布比卡因+Fer-1组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,布比卡因组细胞色素C蛋白表达增高,Bax/Bcl-2、xCT、GPX4表达,以及PI3K p85α/PI3K、p-AKT(Thr308)/AKT、p-AKT(Ser473)/AKT和p-mTOR(Ser2448)/mTOR比值降低,差异有统计学意义(P<0.001)。验证实验结果显示,与对照组比较,布比卡因+740Y-P组细胞活力和GSH水平升高,Fe^(2+)水平和细胞色素C蛋白表达降低(P<0.001)。结论 布比卡因可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活诱导膀胱癌细胞凋亡和铁死亡。

大黄素对精神分裂症大鼠海马组织PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的:探讨大黄素调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对精神分裂症(SP)大鼠神经损伤及认知功能的影响。方法:通过注射地卓西平(MK-801)建立SP大鼠模型,并将正常大鼠为对照组,SP大鼠随机分为SP组、不同剂量(20、40、60mg/kg)大黄素组、60mg/kg大黄素+LY294002组,刻板行为及共济失调评分标准评价大鼠行为学功能;Morris水迷宫实验评估大鼠认知功能;试剂盒检测脑组织乙酰胆碱酯酶(AchE)、乙酰胆碱(Ach)活性;HE检测海马组织病理学变化;qRT-PCR检测脑组织中脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA、钙依赖性蛋白激酶(CaMKⅡ)mRNA表达;Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达。结果:与对照组相比,SP组穿越平台次数、Ach活性、BDNF mRNA、CaMKⅡmRNA表达、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表达显著降低,刻板行为及共济失调评分、平均逃避潜伏期、AchE活性显著增加(P<0.05);但不同剂量大黄素干预后,穿越平台次数、Ach活性、BDNF mRNA、CaMKⅡmRNA表达、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表达显著增加,刻板行为及共济失调评分、平均逃避潜伏期、AchE活性显著降低,组间有差异(P<0.05);60mg/kg大黄素联合LY294002较60mg/kg大黄素组穿越平台次数、Ach活性、BDNF mRNA、CaMKⅡmRNA表达、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表达显著降低,刻板行为及共济失调评分、平均逃避潜伏期、AchE活性显著增加(P<0.05)。结论:大黄素通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路改善SP大鼠认知能力,发挥神经保护功能。

PI3K/AKT/mTOR信号通路在膀胱癌中的作用

目的:分析磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信号通路在膀胱癌中的作用。方法:选取60只SD健康雄性大鼠,采用随机数字法分为对照组、模型组和干预组,每组各20只。模型组和干预组大鼠以致癌物BBN灌胃8周建立膀胱癌模型,建模成功后,干预组大鼠注射PI3K抑制剂,连续干预6周。观察三组大鼠膀胱组织病理学变化,比较各组大鼠血清炎性因子指标、氧化应激指标、PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达和CK-19、CYFRA21-1水平的变化。结果:与对照组相比,模型组和干预组大鼠血清转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、C反应蛋白(CRP)、丙二醛、一氧化氮、PI3K、AKT、mTOR蛋白表达量、CK-19、CYFRA21-1水平升高,总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)水平降低(P<0.05)。与模型组相比,干预组血清TGF-β1、IL-1β、CRP、丙二醛、一氧化氮、PI3K、AKT、mTOR蛋白表达量、CK-19、CYFRA21-1水平均降低,T-AOC、SOD水平升高(P<0.05)。结论:PI3K抑制剂通过PI3K/AKT/mTOR信号通路遏制膀胱癌的发展。

基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研究破淤汤对缺血性糖尿病足溃疡大鼠促血管新生的作用

目的:基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探索破淤汤对缺血性糖尿病足溃疡大鼠促血管新生的作用机制。方法:将造模成功的缺血性糖尿病足溃疡大鼠随机分为非药物组、西洛他唑组、破淤汤低剂量组、破淤汤中剂量组、破淤汤高剂量组,各组给予相应药物或非药物干预后,通过创面肉芽组织HE染色观察组织结构,通过CD31免疫组化染色观察血管新生,通过酶联免疫吸附(ELISA)双抗体夹心法检测血清中VEGFR-2水平,通过Western免疫印迹法检测PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白表达情况。结果:HE染色结果显示低剂量破淤汤组与非药物组比较,新生毛细血管明显增多,同样含大量炎细胞;中、高剂量破淤汤组较非药物组改善明显,新生毛细血管多,炎症细胞少,接近于正常对照组。与非药物组比较,西洛他唑组及低、中、高剂量破淤汤组大鼠糖尿病足溃疡肉芽组织微血管数目、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR表达水平及大鼠血清VEGFR2表达量均升高(P均﹤0.05)。结论:破淤汤可能通过促进缺血溃疡组织VEGER-2蛋白表达,促进PI3K/AKT/mTOR信号通路关键蛋白的表达来促进缺血溃疡组织的血管新生。

基于PTEN/PI3K/Akt信号通路探讨糖通饮对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的保护作用

目的探讨糖通饮对糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞损伤的保护作用。方法高脂高糖饮食联合链脲佐菌素(STZ)多次注射建立DN大鼠模型,并随机分为模型组、厄贝沙坦组(13.5mg/kg)和糖通饮低、中、高剂量组(930、1860、3720mg/kg),另设置正常组,各组灌胃给予相应剂量药物,每天1次,连续8周。检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、24h尿蛋白(24-hUP)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)水平,HE染色观察各组大鼠肾组织病理形态学改变,透射电子显微镜观察肾足细胞超微结构变化,RT-qPCR法检测肾组织PTEN、PI3K、Akt、nephrin、podocin、CD2APmRNA表达,Westernblot法检测肾组织PTEN、PI3K、Akt、p-Akt、nephrin、podocin、CD2AP蛋白表达。结果与模型组比较,糖通饮各剂量组FBG、24-hUP、Scr、BUN水平降低(P<0.05,P<0.01),肾组织病理形态和足细胞超微结构得到改善,PTEN、nephrin、podocin、CD2APmRNA和蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),p-Akt蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01);糖通饮中、高剂量组PI3K、AktmRNA和蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论糖通饮对DN大鼠肾组织足细胞有保护作用,其机制可能与调节PTEN/PI3K/Akt信号通路有关。

基于PI3K/AKT/mTOR通路研究脑清通颗粒对脑缺血再灌注大鼠的保护作用

目的:探讨脑清通颗粒对脑缺血再灌注大鼠的保护作用及机制。方法:60只大鼠随机分为假手术对照组、模型对照组、尼莫地平组、脑清通颗粒低、中、高剂量组,每组10只。除假手术对照组外,其余各组采用高脂饲料喂养、复合应激刺激和线栓法制备肝热痰瘀证脑缺血再灌注大鼠模型。从第6周起,假手术对照组和模型对照组用等体积生理盐水灌胃,其余各给药组用相应药物灌胃,1次/d,连续给药7d。观察大鼠体征表现;采用神经功能评分、TTC染色及脑梗死体积测定评价脑缺血再灌注模型;尼氏染色观察神经细胞变化;生化法检测SOD和MDA含量、ELISA法检测TNF-α和IL-6含量;免疫组化检测PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达;Western blot法检测p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的蛋白表达。结果:模型对照组大鼠体征表现符合临床肝热痰瘀证基本特征,神经功能评分、脑梗死体积显著增加(P<0.01),大鼠血清SOD含量明显降低(P<0.01),MDA、TNF-α和IL-6含量明显升高(P<0.01),脑组织PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达均明显降低(P<0.01或P<0.05),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的蛋白表达均明显降低(P<0.01);脑清通颗粒1.3g/kg、2.6g/kg、5.2g/kg组可改善大鼠体征表现,降低神经功能评分和脑梗死体积(P<0.01或P<0.05),升高血清SOD含量(P<0.01),降低MDA、TNF-α和IL-6含量(P<0.01),升高脑组织PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达(P<0.01),升高p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的蛋白表达(P<0.01)。结论:脑清通颗粒可能是通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路达到对脑缺血再灌注损伤的脑保护作用。

山奈酚通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路改善视网膜氧化应激损伤

目的探讨山奈酚减轻视网膜氧化应激损伤的作用机制。方法H_(2)O_(2)处理ARPE-19细胞,构建体外视网膜氧化应激损伤模型,CCK-8评估细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡。25只雄性SD大鼠随机分为5组:对照组、模型组及山奈酚低剂量(12.5 mg/kg)组、中剂量(25 mg/kg)组和高剂量(50 mg/kg)组;对照组动物正常饲养,模型组和治疗组动物给予急性视网膜缺血/再灌注损伤处理,构建视网膜氧化应激损伤模型。检测超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的细胞内活性,H-E染色观察视网膜结构完整性,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎性细胞因子的表达,Western blot评价凋亡自噬的表达和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)/雷帕霉素机制靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。结果体外细胞实验表明,与对照组相比,山奈酚能显著提高ARPE-19氧化应激损伤细胞的活力和减少细胞凋亡(P<0.05)。体内实验表明,与模型组相比,山奈酚能减轻视网膜氧化应激损伤;显著降低MDA表达和升高SOD表达(P<0.05);显著降低血管内皮生长因子(VEGF)和γ-干扰素(IFN-γ)的分泌,增加白细胞介素-10(IL-10)的分泌(P<0.05);同时能显著增强B细胞淋巴瘤/白血病-2(BCL-2)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)、PI3K、磷酸化mTOR(p-mTOR)和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达,抑制Bcl-2同源结构域蛋白1抗体(Beclin1)表达(P<0.05)。结论山奈酚通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路减轻视网膜氧化应激损伤。

基于Akt/mTOR信号通路探讨洋地黄毒苷调控甲状腺滤泡上皮细胞自噬与凋亡的机制

目的探究洋地黄毒苷对脂多糖刺激下的人甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-roi3-1凋亡与自噬的影响及其作用机制。方法①将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷低剂量组、脂多糖+洋地黄毒苷中剂量组及脂多糖+洋地黄毒苷高剂量组,各组进行对应处理后,CCK-8法检测各组细胞活力,免疫荧光染色观察各组细胞自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bcl-2同源结构域蛋白抗体(Beclin 1)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70S6K蛋白表达情况。②将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷组、脂多糖+洋地黄毒苷+自噬抑制剂组,各组进行对应处理后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR及p70S6K蛋白表达情况。结果①与脂多糖组比较,脂多糖+洋地黄毒苷各组的细胞活力均明显升高(P均<0.05);LC3荧光染色强度随洋地黄毒苷剂量增加逐渐增强,细胞凋亡率均明显降低(P均<0.05);细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),细胞中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p70S6K蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。②与脂多糖组比较,脂多糖+洋地黄毒苷组细胞凋亡率明显降低(P<0.05);细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),细胞中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p70S6K蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。与脂多糖+洋地黄毒苷组比较,脂多糖+洋地黄毒苷+自噬抑制剂组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),细胞中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p70S6K蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。结论洋地黄毒苷能够促进脂多糖刺激下Nthy-roi3-1细胞自噬,抑制细胞凋亡,该作用可能与其抑制Akt/mTOR信号通路的激活有关。