电针对帕金森病小鼠SIRT3/PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬的影响

目的:观察电针“风府”“太冲”“足三里”对帕金森病(PD)小鼠中脑黑质沉默调节蛋白3(SIRT3)及其下游PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)、PARK2基因编码蛋白(Parkin)介导的线粒体自噬的影响,探讨电针治疗PD的可能机制。方法:C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、电针组、假电针组,每组12只。采用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶复制PD小鼠模型。电针组小鼠给予针刺“风府”“太冲”“足三里”,每天1次,每次20 min,连续12 d。以旷场实验评估各组小鼠的运动能力;免疫组织化学法检测各组小鼠中脑黑质区酪氨酸羟化酶(TH)、α-突触核蛋白(α-syn)阳性表达;透射电镜观察黑质区神经元超微结构;免疫荧光染色法检测小鼠黑质自噬轻链蛋白3(LC3)的阳性表达;实时荧光定量PCR法检测小鼠黑质TH、α-syn、SIRT3、PINK1、Parkin和线粒体自噬受体蛋白P62、Beclin-1、LC3Ⅱ mRNA表达水平;Westernblot法检测小鼠黑质TH、α-syn、SIRT3、PINK1、Parkin、P62、Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达水平。结果:与对照组比较,模型组小鼠运动总距离、运动总时间、运动速度和进入中央区域的次数均下降(P<0.01);TH、LC3阳性表达减少(P<0.01),α-syn阳性表达增加(P<0.01);部分线粒体肿胀,线粒体嵴断裂减少,溶酶体数量减少;中脑黑质TH、SIRT3、PINK1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.01),α-syn和P62 mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,电针组小鼠运动总距离、运动总时间、运动速度和进入中央区域的次数增加(P<0.01,P<0.05),TH、LC3阳性表达增加(P<0.01,P<0.05),α-syn阳性表达减少(P<0.01),线粒体数量增多,出现自噬小体,肿胀减轻,中脑黑质TH、SIRT3、PINK1、Parkin、Beclin-1、LC3ⅡmRNA及蛋白表达水平升高(P<0.01,P<0.05),α-syn、P62mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.01);假电针组运动总距离、总时间增加(P<0.05),TH阳性表达增加(P<0.05),α-syn阳性表达减少(P<0.05),部分线粒体肿胀,未见自噬体出现,TH、SIRT3、Parkin、LC3Ⅱ蛋白表达水平升高(P<0.01,P<0.05),P62 mRNA、α-syn mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.01,P<0.05),LC3Ⅱ mRNA表达水平升高(P<0.05)。与假电针组比较,电针组运动总时间延长(P<0.01),α-syn阳性表达及mRNA表达水平下降(P<0.01,P<0.05),TH、SIRT3、PINK1、Parkin mRNA及SIRT3蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:电针“风府”“太冲”“足三里”可改善PD小鼠运动能力,其机制可能是通过激活SIRT3/PINK1/Parkin通路,增强线粒体自噬,促进PD小鼠中脑黑质TH表达,减少α-syn聚集,从而发挥神经保护作用。

多巴胺能神经元内质网-线粒体轴定位蛋白DJ-1、PINK1、Parkin在帕金森病中的作用机制

查阅相关文献,从蛋白质/核酸脱糖苷(DJ-1)、磷酸酶张力蛋白同源物诱导的假定蛋白激酶1(PINK1)、E3泛素连接酶(Parkin)的结构,分布及DJ-1、PINK1、Parkin与帕金森病(PD)的发病机制3个方面对多巴胺(DA)能神经元内质网-线粒体轴定位蛋白DJ-1、PINK1、Parkin在PD中的作用机制进行概述。结果发现,DJ-1、PINK1、Parkin参与内质网-线粒体的信号调节,并调控DA能神经元,从而引发一系列神经病理学特征,如线粒体功能障碍、氧化应激、细胞凋亡等,继而引发PD。但关于DJ-1、PINK1、Parkin参与PD致病机制的研究较少,详细的发病途径与病理机制还需进一步研究,以便为防治PD提供新的研究思路。

基于PINK1/parkin信号转导通路研究灵芝孢子对糖尿病心肌损伤的保护作用

目的探讨灵芝孢子对糖尿病(DM)大鼠心肌损伤的保护作用及对PTEN诱导假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(parkin)信号通路的作用机制。方法将40只雄性SD大鼠随机分成对照(NC)组、高脂高糖饮食(HFD)组、DM组和灵芝孢子(GLS)组各10只。12 w末,记录各组末次体质量及空腹血糖。麻醉处死大鼠后,采集心脏组织,计算心脏指数,并检测丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)含量。苏木素-伊红染色(HE)和马松(Masson)染色观察心脏病理学变化。Western印迹检测PINK1/parkin通路蛋白、自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白,免疫组织化学技术验证PINK1、parkin的表达水平,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色评估细胞凋亡情况。结果与NC组相比,HFD组体质量明显增加,DM组体质量明显减轻,血糖水平明显升高(P<0.05);HFD组和DM组心脏指数、MDA含量、PINK1、parkin、p-parkin、微管相关蛋白轻链(LC)3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2同源结构域蛋白抗体(beclin)1、Bcl-2相关X蛋白(Bax)/Bcl-2蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率及血管周围胶原含量明显增加,SOD活性、p62蛋白表达水平显著下降(均P<0.05)。与DM组相比,HFD组和GLS组体质量、SOD活性、p62蛋白表达水平明显增加,血糖水平、心脏指数、MDA含量、PINK1、parkin、p-parkin、LC3、beclin1、Bax/Bcl-2蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率、血管周围胶原含量明显降低(均P<0.05)。结论灵芝孢子可减轻DM大鼠心肌损伤,改善纤维化程度,具有良好的抗氧化活性,可逆转心肌细胞过度自噬,抑制细胞凋亡,其保护作用可能与下调PINK1/parkin信号通路有关。

线粒体功能障碍与帕金森病关系的研究进展

帕金森病是一种多因素引发的神经退行性疾病,表现为黑质纹状体致密部多巴胺能神经元退行性病变。越来越多的研究表明,线粒体功能障碍在帕金森病形成过程中起重要作用。线粒体蛋白parkin,PTEN诱导的激酶1和DJ-1通路的变化以及α突触核蛋白的过表达均是引起线粒体功能障碍的主要原因。目前,研究人员正在努力寻找能够改善线粒体功能从而治疗帕金森病的药物,有些药物已进入临床试验阶段。

基于PINK1/Parkin通路探讨灵芝孢子对糖尿病肾病模型大鼠肾脏细胞凋亡的影响

目的基于PTEN诱导假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)通路研究灵芝孢子对糖尿病肾病(DN)模型大鼠的肾脏细胞凋亡的影响。方法32只SPF级雄性SD大鼠(180~200 g),随机分成正常对照(NC)组、高脂高糖(HF)组、DN模型(DN)组和灵芝孢子(GLSP)组。除NC组外,其余各组均采用高脂、高糖饲养,同时DN组和GLSP组均联合腹腔注射2%链脲佐菌素(STZ,50 mg/kg)。GLSP组每日灌胃给予灵芝孢子〔300 mg/(kg•d)〕持续3个月,其余组均灌胃给予等量生理盐水〔10 ml/(kg•d)〕。每周测定各组空腹血糖。12 w后评估肾脏功能,用试剂盒检测尿素氮、血清肌酐、24 h尿蛋白等生化指标。苏木素-伊红(HE)、过碘酸希未反应(PAS)和Masson染色用于检查肾脏病理学。通过TUNEL法观察大鼠肾脏组织凋亡细胞的分布及凋亡率情况。通过免疫组化检测肾脏组织中P62、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平。Western印迹检测PINK1/Parkin通路涉及的关键蛋白PINK1、Parkin及微管相关蛋白1轻链(LC)3、P62、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved)-Caspase3、Bax、Bcl-2表达水平。结果与NC组相比,DN组尿中出现大量尿蛋白,血清肌酐及尿素氮水平明显升高(P<0.01),肾小体直径增大、肾小囊腔变小、肾小球内细胞数增多并有糖原累积、肾小球内含有大量的胶原纤维,肾组织中PINK1、Parkin、LC3的蛋白表达显著降低、P62表达显著升高,凋亡相关蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3表达明显升高,Bcl-2/Bax表达明显降低(P<0.01),肾脏凋亡荧光强度明显增加(P<0.01)。与DN组相比,GLSP组肾脏滤过功能明显改善(P<0.01),肾脏病理损伤缓解,肾小球体积有明显减小、肾组织胶原纤维覆盖面积明显降低、糖原明显减少;肾组织中PINK1、Parkin表达明显升高、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显增加,P62表达明显下降,且凋亡相关蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3表达明显下降,Bcl-2/Bax表达明显升高(P<0.01),肾脏凋亡荧光强度明显降低(P<0.01)。结论灵芝孢子可能调控PINK1/Parkin途径,激活肾脏细胞自噬有关,抑制重要的促凋亡蛋白的表达,减轻高糖水平对肾脏的损害,抑制细胞凋亡。

加味桂枝茯苓汤通过PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬途径减轻PDPN大鼠坐骨神经损伤的作用机制

目的:观察加味桂枝茯苓汤(JGFD)通过PTEN诱导假定激酶1(PINK1)/帕金森病蛋白(Parkin)信号通路调控线粒体自噬途径减轻痛性糖尿病周围神经病变(PDPN)大鼠坐骨神经损伤的作用机制。方法:通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备PDPN模型。成模后随机分为JGFD高、中、低剂量组(JGFD-H、JGFD-M、JGFD-L,39.6、19.8、9.9 g·kg^(-1)·d^(-1))、阳性药组(硫辛酸胶囊,LA,50 mg·kg^(-1)·d^(-1))、模型组(PDPN),并设立空白组(CON)。成模后持续给药干预8周。分别检测干预第0、2、4、8周大鼠体质量和空腹血糖,第0、8周大鼠机械痛阈值和热痛阈值,第8周大鼠运动神经传导速度;苏木素-伊红(HE)染色观察坐骨神经组织形态;透射电镜观察线粒体和自噬小体超微结构;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测坐骨神经组织PINK1、Parkin、p62、酵母Atg6同系物(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测坐骨神经组织PINK1、Parkin、p62、Beclin-1、LC3 mRNA水平。结果:与CON组比较,PDPN组大鼠各时间点体质量显著降低,空腹血糖显著升高,机械痛阈值和热痛阈值显著缩短,运动神经传导速度显著减慢,坐骨神经组织PINK1、Parkin、Beclin-1、LC3蛋白和mRNA表达显著降低、p62蛋白和mRNA表达显著升高(P<0.01);坐骨神经神经纤维水肿,节段性脱髓鞘;髓鞘板层结构排列松散紊乱,线粒体明显肿胀,电子密度减低,嵴断裂消失,未见典型自噬溶酶体和自噬小体结构。与PDPN组比较,JGFD各剂量组体质量明显升高,空腹血糖明显降低(P<0.05,P<0.01);JGFD各剂量组、LA组机械痛阈值和热痛阈值明显延长,运动神经传导速度明显增快,坐骨神经组织PINK1、Parkin、Beclin-1、LC3蛋白和mRNA表达明显升高、p62蛋白和mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01);坐骨神经病理损伤均有不同程度改善;髓鞘形态结构较为完整,线粒体外膜完整或者轻微水肿,JGFD-M组、JGFD-H组可见自噬溶酶体结构。与LA组比较,JGFD-H组体质量明显升高,空腹血糖明显降低,运动神经传导速度明显增快,坐骨神经组织PINK1蛋白和PINK1、Parkin、Beclin-1 mRNA表达明显升高,p62 mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:加味桂枝茯苓汤可能通过调控PINK1/Parkin信号通路,激活线粒体自噬,减轻PDPD大鼠坐骨神经损伤。

肉桂醛通过PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬促进糖尿病大鼠创面愈合机制

目的:采用高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射链尿佐菌素(STZ)及手术制备全层皮肤缺损的方法制备糖尿病大鼠创面模型,观察肉桂醛对糖尿病大鼠创面愈合情况的影响,并基于PTEN诱导假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(Parkin)信号通路介导的线粒体自噬探讨肉桂醛对糖尿病大鼠创面的治疗机制。方法:48只雄性SD大鼠随机分为空白组12只,糖尿病组36只,糖尿病组随机分为模型组、肉桂醛组和贝复新组,每组12只,空白组与模型组创面常规消毒后予生理盐水,肉桂醛组创面局部外敷含4μmol·L^(-1)肉桂醛的聚乙二醇400(PEG 400)凝胶,贝复新组创面外敷贝复新凝胶,每日换药1次。观察各组创面愈合率,取干预后7、14 d大鼠创面组织,苏木素-伊红(HE)染色观察局部组织病理变化,免疫组化(IHC)检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、胶原纤维的表达情况,免疫荧光(IF)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测PINK1、Parkin、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)蛋白和mRNA的表达情况。结果:腹腔注射STZ后,与空白组比较,糖尿病组大鼠随机血糖值显著升高(P<0.01),均高于16.7 mmol·L^(-1),且在造模后一段时间持续保持高血糖状态。与空白组比较,模型组大鼠创面肉芽组织生长、愈合情况较差,创面愈合率显著降低(P<0.01);干预后7 d,空白组创面已有鳞状上皮覆盖,与空白组比较,模型组大鼠创面仅创缘少量结痂,创面中大量炎细胞浸润,组织IL-6、TNF-α蛋白表达水平显著上升(P<0.01),PINK1、Parkin、LC3Ⅱ蛋白表达及mRNA水平显著降低(P<0.01);干预后14 d,空白组创面肉芽组织成熟,愈合良好,与空白组比较,模型组创面炎细胞浸润和红细胞渗出尚未完全消退,组织VEGF、胶原纤维蛋白表达水平显著降低(P<0.01),PINK1、Parkin、LC3Ⅱ蛋白表达及mRNA水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,肉桂醛组和贝复新组大鼠创面愈合情况较好,创面愈合率显著升高(P<0.01),干预后7 d组织IL-6、TNF-α蛋白表达水平显著降低(P<0.01),PINK1、Parkin及LC3Ⅱ蛋白表达及mRNA水平显著升高(P<0.01),干预后14 d组织VEGF、胶原纤维蛋白表达水平显著上升(P<0.01),PINK1、Parkin、LC3Ⅱ蛋白表达及mRNA水平显著降低(P<0.01)。结论:肉桂醛能促进糖尿病创面愈合,上调创面愈合率,降低炎症因子IL-6、TNF-α的水平,增加VEGF、胶原纤维蛋白的水平,其机制可能是通过调节PINK1/Parkin信号通路表达,激活线粒体自噬,抑制炎症反应,增加血管新生和胶原合成,从而达到促进糖尿病大鼠创面愈合的目的。

针刺对运动性骨骼肌损伤大鼠骨骼肌线粒体自噬的影响

目的:通过观察针刺对大负荷运动大鼠骨骼肌线粒体自噬相关蛋白表达的影响,探讨针刺在运动性骨骼肌损伤修复中的作用及其机制。方法:将128只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组:空白对照(control,C;n=8)组、单纯运动(exercise,E;n=40)组、单纯针刺(acupuncture,A;n=40)组和运动针刺(exercise and acupuncture,EA;n=40)组。其中,E和EA组进行1次下坡跑运动,A组和EA组(运动后即刻)施加针刺处理。后3组根据干预后不同时相又分为0 h、12 h、24 h、48 h和72 h亚组(n=8),分别于对应时点分离比目鱼肌进行检测,使用透射电子显微镜观察骨骼肌线粒体超微结构变化;采用ELISA法检测比目鱼肌线粒体定量酶柠檬酸合成酶(CS)的含量变化;应用Western blot法检测骨骼肌PTEN诱导假定激酶1(PINK1)、parkin和微管相关蛋白1轻链3(LC3)的蛋白表达变化。结果:1次大负荷运动后大鼠比目鱼肌线粒体出现明显肿胀和肌膜下积聚等超微结构异常变化,伴有大量自噬体形成;同时CS的含量明显减少(P<0.05);线粒体自噬蛋白PINK1、parkin和LC3均出现一过性的表达升高(P<0.05)。运动后针刺明显改善了线粒体超微结构的异常变化,减少自噬溶酶体的出现,同时抑制CS的含量减少,下调PINK1、parkin和LC3在线粒体上的表达(P<0.05)。结论:1次大负荷运动后骨骼肌线粒体结构和数量受损,通过激活PINK1/parkin途径诱发线粒体自噬的过度发生。大负荷运动后针刺可以缓解骨骼肌线粒体的损伤,其作用机制可能是通过下调线粒体外膜蛋白PINK1表达,抑制其对下游胞浆蛋白parkin的招募,进而影响LC3与线粒体的结合以抑制线粒体自噬过度激活。