PTEN诱导激酶1在高血压小鼠主动脉硬化中的机制研究

目的 探讨PTEN诱导激酶1(PINK1)在高血压模型小鼠主动脉硬化中的作用及其对血管重塑的机制。方法取8~10周龄C57BL/6J雄性小鼠12只,随机分为阴性对照组和高血压造模组,每组6只,于皮下埋植微渗透泵缓慢释放血管紧张素(Ang)Ⅱ以诱导高血压小鼠模型。取8~10周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠24只,随机分为空白对照组、假手术组、高血压模型组、PINK1处理组4组,每组6只。空白对照组,假手术组小鼠予0.9%氯化钠溶液(灌泵)+pLenti-NC(腹腔内注射),高血压模型组小鼠予AngⅡ(灌泵)+pLenti-NC (腹腔内注射),PINK1处理组小鼠予AngⅡ(灌泵)+pLenti-PINK1(腹腔内注射)。利用BP98A鼠尾套管无创血压仪监测血压变化,采用“点对点”法监测主动脉脉搏波传导速度(PWV),测定血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平,H-E染色观察主动脉组织结构,Western印迹法分析PINK1、CollagenⅠ、LC3B-Ⅱ、p62蛋白质相对表达量,免疫荧光染色观察CollagenⅠ表达。结果 构建小鼠模型的收缩压监测结果显示:灌注后第1~8天和第10、12、14天,高血压造模组小鼠的收缩压均显著高于阴性对照组(P值均<0.01);灌注第14天,阴性对照组小鼠PWV显著短于高血压造模组(P<0.05);Western印迹法检测结果显示,阴性对照组PINK1相对表达量显著高于高血压造模组(P<0.05);阴性对照组的CollagenⅠ相对表达量显著低于高血压造模组(P<0.01)。PINK1回补实验结果显示:灌注后第3~8天和灌注后第10、12、14天,PINK1处理组小鼠收缩压显著低于高血压模型组(P值均<0.01);PINK1处理组小鼠的PWV显著短于高血压模型组小鼠(P<0.01)。高血压模型组小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著高于假手术组(P值均<0.001),PINK1处理组IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著低于高血压模型组(P值均<0.01)。Western印迹法检测结果显示,与假手术组及空白对照组比较,高血压模型组中PINK1、LC3B-Ⅱ蛋白质相对表达量均显著降低(P值均<0.01),CollagenⅠ、p62蛋白质相对表达量均显著增高(P值均<0.01);PINK1处理组PINK1、LC3B-Ⅱ蛋白质相对表达量均显著高于高血压模型组(P值均<0.01),CollagenⅠ、p62蛋白质相对表达量均显著低于高血压模型组(P值均<0.01)。CollagenⅠ免疫荧光染色显示,CollagenⅠ呈束状,联结成网。与空白对照组相比,高血压模型组大鼠心肌中CollagenⅠ表达量均增高,经PINK1回补后CollagenⅠ表达量降低。结论 PINK1过表达后,可以减轻高血压模型小鼠中血管炎症,促进细胞自噬,抑制血管纤维化,为高血压引起的血管硬化防治提供了新的思路和方向。

香芹酚通过增强PTEN诱导激酶1/Parkin介导的自噬而减轻心肌缺血再灌注损伤的动物及细胞实验

背景在心血管疾病中,PTEN诱导激酶1(PINK1)/Parkin介导的自噬通过有效地清除受损的线粒体和过量的活性氧(ROS)来维持细胞内线粒体的动态平衡。香芹酚具有减少心肌细胞中ROS生成和降低线粒体损伤的作用。然而,目前尚不清楚香芹酚对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中自噬的影响。目的通过动物及细胞实验探讨香芹酚对MIRI的治疗作用及其机制。方法本研究时间为2020年5月至2021年5月。动物实验:将成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为Sham组(A组)、MIRI组(B组)、MIRI+20 mg/kg香芹酚组(C组)和MIRI+60 mg/kg香芹酚组(D组),每组12只。B、C、D组大鼠建立MIRI模型,A组大鼠接受相同的手术,但不结扎冠状动脉左前降支;术前15 min,C组和D组大鼠腹腔注射相应剂量的香芹酚,A组和B组大鼠给予等体积的0.9%氯化钠溶液。检测A、B、C、D组大鼠血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)水平,心肌梗死面积,心肌病变情况,心肌组织中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表达水平及微管相关蛋白轻链3(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ。细胞实验:将H9C2细胞分为对照组(E组)、缺氧/复氧(H/R)组(F组,进行H/R处理)、H/R+香芹酚组(G组,用100μmol/L香芹酚预处理6 h后进行H/R处理)、H/R+香芹酚+阴性对照小干扰RNA(NC-siRNA)组(H组,转染NC-siRNA后用100μmol/L香芹酚预处理6 h,然后进行H/R处理)和H/R+香芹酚+靶向PINK1的小干扰RNA(PINK1-siRNA)组(I组,转染PINK1-siRNA后用100μmol/L香芹酚预处理6 h,然后进行H/R处理)。检测E、F、G、H、I组细胞活力、细胞凋亡率,H9C2细胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ。结果动物实验:B、C、D组大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平高于A组(P<0.05);C、D组大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平低于B组(P<0.05);D组大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平低于C组(P<0.05)。A组大鼠心肌梗死面积为0。C、D组大鼠心肌梗死面积小于B组(P<0.05);D组大鼠心肌梗死面积小于C组(P<0.05)。HE染色结果显示,A组大鼠心肌细胞排列整齐,细胞核明显,无炎性细胞浸润;B组大鼠心肌组织广泛坏死,心肌纤维排列紊乱,大量炎性细胞浸润;C、D组大鼠心肌细胞排列较整齐,细胞坏死程度和范围明显减轻。Masson三色染色结果显示,A组大鼠心肌组织以心肌细胞为主,没有明显的胶原成分;B组大鼠心肌组织心肌纤维化明显,仅有少量心肌细胞存在;C、D组大鼠心肌组织的胶原纤维含量明显减少。定量分析结果显示,B、C、D组大鼠心肌纤维化百分比高于A组(P<0.05);C、D组大鼠心肌纤维化百分比低于B组(P<0.05);D组大鼠心肌纤维化百分比低于C组(P<0.05)。TUNEL染色结果显示,B、C、D组大鼠心肌组织TUNEL阳性率高于A组(P<0.05);C、D组大鼠心肌组织TUNEL阳性率低于B组(P<0.05);D组大鼠心肌组织TUNEL阳性率低于C组(P<0.05)。B、C、D组大鼠心肌组织中PINK1、Beclin1蛋白表达水平低于A组,B、C组大鼠心肌组织中Parkin蛋白表达水平低于A组,B组大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于A组,C、D组大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于A组(P<0.05);C、D组大鼠心肌组织中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于B组(P<0.05);D组大鼠心肌组织中Parkin、Beclin1蛋白表达水平高于C组,(P<0.05)。细胞实验:F、G、H、I组细胞活力小于E组(P<0.05);G、H组细胞活力大于F组(P<0.05);I组细胞活力小于G、H组(P<0.05)。F、G、H、I组细胞凋亡率高于E组(P<0.05);G、H、I组细胞凋亡率低于F组(P<0.05);I组细胞凋亡率高于G、H组(P<0.05)。F组H9C2细胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于E组(P<0.05);G、H组H9C2细胞中PINK1、Beclin1蛋白表达水平低于E组、高于F组,Parkin蛋白表达水平高于F组,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于E、F组(P<0.05);I组H9C2细胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于E、G、H组,Beclin1蛋白表达水平高于F组(P<0.05)。结论动物及细胞实验均表明,香芹酚通过激活PINK1/Parkin通路增强自噬,从而减轻MIRI。

蠲痹汤含药血清调控线粒体自噬抑制白细胞介素1β诱导的关节软骨细胞损伤

背景:软骨细胞线粒体自噬的缺陷会引起细胞凋亡和基质消失等软骨细胞退行性病变的变化。目的:探讨蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β诱导的大鼠膝关节软骨细胞炎症反应和凋亡的影响及可能作用机制。方法:50只雄性SD大鼠随机给予生理盐水、蠲痹汤低、中、高剂量(1.24,2.48,4.96 g/kg)、塞来昔布(阳性药物),连续灌胃2周后获得含药血清。①分离软骨细胞,将其随机分为对照组、白细胞介素1β组、蠲痹汤低、中、高剂量含药血清组及阳性药物血清组。CCK-8法检测细胞存活率、免疫荧光双染检测线粒体自噬水平、免疫荧光检测磷酸化腺苷酸激活蛋白激酶水平、Western blot检测PTEN诱导激酶1/Parkin通路相关蛋白和裂解的半胱氨酸蛋白酶蛋白3表达、ELISA检测炎症因子水平;②分别采用PTEN诱导激酶1 siRNA和Compound C进行干预,探究AMPK/PTEN诱导激酶1/Parkin通路在蠲痹汤含药血清调控线粒体自噬中的作用。结果与结论:①与对照组比较,白细胞介素1β组软骨细胞存活率、Ⅱ型胶原蛋白表达、磷酸化腺苷酸激活蛋白激酶、PTEN诱导激酶1、Parkin和微管相关蛋白1轻链3蛋白水平以及线粒体自噬水平明显降低(P<0.05),而裂解的半胱氨酸蛋白酶蛋白3蛋白水平、白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α水平显著升高(P<0.05);与白细胞介素1β组比较,蠲痹汤各剂量含药血清组和阳性药物血清组上述各项指标呈现相反的变化(P<0.05);②PTEN诱导激酶1 siRNA可显著抑制蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β处理软骨细胞线粒体自噬的影响,降低蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症与凋亡的保护作用;Compound C逆转了蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β处理软骨细胞中PTEN诱导激酶1/Parkin信号通路的影响。结论:蠲痹汤含药血清通过影响线粒体自噬水平来抑制软骨细胞炎症和凋亡,从而减轻白细胞介素1β诱导的软骨细胞退化,其机制可能与调控AMPK/PTEN诱导激酶1/Parkin通路有关。

蓝萼甲素调节PINK1/Parkin信号通路对IL-1β诱导的关节软骨细胞自噬和凋亡的影响

目的:探讨蓝萼甲素(GLA)调节PTEN诱导的激酶1(PINK1)/E3泛素连接酶(Parkin)信号通路对白细胞介素1β(IL-1β)诱导的关节软骨细胞自噬和凋亡的影响。方法:将关节软骨细胞分为Control组、IL-1β组、L-GLA组、M-GLA组、H-GLA组、Suramin组;细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测关节软骨细胞增殖;TEM检测关节软骨细胞自噬;流式细胞仪检测关节软骨细胞凋亡;ELISA检测关节软骨细胞中炎性因子(MMP3、TNF-α、MMP13)和活性氧(ROS)水平;蛋白印迹法检测关节软骨细胞中裂解的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)I、LC3Ⅱ、P62、PINK1、Parkin蛋白表达。结果:与Control组相比,IL-1β组存活率、LC3Ⅱ/Ⅰ、PINK1、Parkin降低,自噬空泡数、凋亡率、MMP3、TNF-α、MMP13、ROS、cleaved caspase-3、P62升高(P<0.05);L-GLA组、M-GLA组、H-GLA组存活率、自噬空泡数、LC3Ⅱ/Ⅰ、PINK1、Parkin高于IL-1β组,凋亡率、MMP3、TNF-α、MMP13、ROS、cleaved caspase-3、P62低于IL-1β组(P<0.05);Suramin组存活率、自噬空泡数、LC3Ⅱ/Ⅰ、PINK1、Par-kin低于H-GLA组,凋亡率、MMP3、TNF-α、MMP13、ROS、cleaved caspase-3、P62高于H-GLA组(P<0.05)。结论:GLA通过激活IL-1β诱导的关节软骨细胞自噬,抑制细胞凋亡,进而抑制OA的进展,其机制可能是通过激活PINK1/Parkin信号通路实现的。

鼠尾草酸调节PINK1/Parkin信号通路对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞的影响

目的探究鼠尾草酸调节磷酸酶基因(PTEN)诱导假定激酶(PINK)1/E3泛素连接酶(Parkin)信号通路对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)的影响。方法将HBZY-1细胞分为对照组(含糖量5.8 mmol/L),高糖组(含糖量26 mmol/L),低剂量鼠尾草酸组(含50 mg/kg鼠尾草酸),高剂量鼠尾草酸组(含100 mg/kg鼠尾草酸)。采用透射电镜、流式细胞仪观察高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞自噬、凋亡变化状况,Western印迹检测PINK1/Parkin信号通路蛋白的表达量。结果与对照组相比,高糖组、低剂量鼠尾草酸组、高剂量鼠尾草酸组HBZY-1细胞自噬率、PINK1、Parkin、超氧化物歧化酶(SOD)表达显著降低,细胞凋亡率、白细胞介素(IL)-1β、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平显著升高(P<0.05);与高糖组对比,低剂量鼠尾草酸组、高剂量鼠尾草酸组HBZY-1细胞自噬率、PINK1、Parkin、SOD水平显著升高,细胞凋亡率、MDA、TNF-α、IL-1β表达显著下降(P<0.05);与低剂量鼠尾草酸组相比,高剂量鼠尾草酸组的HBZY-1细胞自噬率、PINK1、Parkin、SOD表达上升,细胞凋亡率、TNF-α、MDA、IL-1β表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论鼠尾草酸可加强高糖诱导的肾小球系膜细胞自噬率,抑制HBZY-1的凋亡,可能与其调节PINK1/Parkin信号通路有一定的关联性。

灵芝孢子干预糖尿病大鼠睾丸组织线粒体自噬及细胞的凋亡

背景:男性生殖障碍作为糖尿病的常见并发症近年来受到越来越多的关注。灵芝孢子具有降糖、抗氧化、抗炎等功效,但其对于糖尿病睾丸组织的调控机制尚未完全阐明。目的:探讨灵芝孢子对糖尿病大鼠睾丸组织PTEN诱导激酶1/E3泛素蛋白连接酶通路及细胞凋亡的影响。方法:采用随机数字表法将40只雄性SD大鼠分为正常组、高脂高糖组、糖尿病组、灵芝孢子干预组,每组10只:高脂高糖组、糖尿病组、灵芝孢子干预组给予高脂高糖饮食至实验结束;高脂高糖饮食1个月后,糖尿病组、灵芝孢子干预组腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg建立2型糖尿病模型;造模成功后,灵芝孢子干预组灌胃给予灵芝孢子300 mg/(kg·d),其余3组灌胃给予等量生理盐水,持续给药12周。给药结束后,检测大鼠精子数量和形态、睾丸组织形态结构、血清睾酮和睾丸组织氧化应激水平,免疫组化分析PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶、抗核孔蛋白表达,Western blotting检测睾丸组织中PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶、抗核孔蛋白、程序性死亡受体1、微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ、caspase3、剪切caspase3的蛋白表达。结果与结论:①与正常组和高脂高糖组相比,糖尿病组大鼠精子数量减少(P<0.01),精子畸形率增加(P<0.01),血清睾酮浓度降低(P<0.01);与糖尿病组相比,灵芝孢子干预组大鼠精子数量增加(P<0.05),畸形率降低(P<0.01),血清睾酮浓度升高(P<0.01);②与正常组和高脂高糖组相比,糖尿病组大鼠睾丸组织中丙二醛水平升高(P<0.01),谷胱甘肽还氧化物酶和超氧化物歧化酶水平降低(P<0.01);与糖尿病组相比,灵芝孢子干预组大鼠睾丸组织中丙二醛水平降低(P<0.01),谷胱甘肽还氧化物酶和超氧化物歧化酶水平升高(P<0.01);③免疫组化染色显示,与正常组和高脂高糖组对比,糖尿病组大鼠睾丸组织中PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶阳性表达减少,抗核孔蛋白阳性表达增加;与糖尿病组相比,灵芝孢子干预组大鼠睾丸组织中PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶阳性表达增加,抗核孔蛋白阳性表达减少;④Western blotting检测显示,与正常组和高脂高糖组相比,糖尿病组PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶、程序性死亡受体1蛋白表达及微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值降低(P<0.05或P<0.01),抗核孔蛋白、caspase3、剪切caspase3的蛋白表达升高(P<0.01);与糖尿病组相比,灵芝孢子干预组PTEN诱导激酶1、E3泛素蛋白连接酶、程序性死亡受体1蛋白表达及微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值升高(P<0.05或P<0.01),抗核孔蛋白、caspase3、剪切caspase3的蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01);⑤结果显示,灵芝孢子可能通过激活PTEN诱导激酶1/E3泛素蛋白连接酶信号通路增强睾丸组织自噬水平,减少组织细胞的凋亡,以此保护睾丸组织。

独活寄生汤抑制NLRP3炎性小体活化治疗痛风性关节炎

背景:研究发现NLRP3炎症小体的激活是痛风性关节炎发病的重要因素,通过调控PTEN诱导激酶1(PTEN-induced kinas 1,PINK1)/Parkin信号通路能有效抑制NLPR3炎性小体的活化。目的:探究独活寄生汤对PINK1/Parkin/NLRP3信号通路的影响。方法:①动物实验:将雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、阳性对照组(秋水仙片0.3 mg/kg)和独活寄生汤低、中、高剂量组(分别给予6.9,13.8,27.6 g/kg),除对照组外其余各组大鼠通过右后踝关节腔注射尿酸单钠盐晶体混悬液构建大鼠痛风性关节炎模型。②细胞实验:将人单核细胞(THP-1)分为空白对照组、模型组、独活寄生汤含药血清组、PINK1 siRNA+独活寄生汤含药血清组,除空白对照组外其余各组细胞采用尿酸钠刺激建立体外痛风性关节炎模型。③观察大鼠踝关节肿胀度、关节周径、步态评分、关节炎症指数和病理分级程度;酶联免疫吸附法检测尿酸、C-反应蛋白、NLRP3和白细胞介素1β水平;免疫印迹法检测PINK1/Parkin/NLRP3通路相关蛋白表达水平;四甲基偶氮唑蓝法检测细胞活性;免疫荧光双染检测线粒体自噬水平;免疫荧光检测NLRP3和白细胞介素1β表达。结果与结论:①与对照组比较,模型组大鼠在6-48 h的踝关节肿胀度、踝关节周径升高(P<0.05),在24和48 h时的步态评分与关节炎症指数升高(P<0.05),血清尿酸和C-反应蛋白水平、病理分级程度、滑膜组织中PINK1、Parkin和NLRP3蛋白表达及白细胞介素1β水平均升高(P<0.05);与模型组比较,独活寄生汤各剂量组大鼠上述指标中除PINK1和Parkin蛋白表达升高(P<0.05)外,其他指标均降低(P<0.05)。②与模型组比较,独活寄生汤含药血清组细胞NLRP3活性、白细胞介素1β水平和线粒体外膜转位蛋白20(TOM20)蛋白水平降低(P<0.05),而增殖抑制率、PINK1、Parkin和LC3B蛋白水平增加(P<0.05);细胞线粒体自噬水平升高(P<0.05),而NLRP3和白细胞介素1β蛋白水平降低(P<0.05)。③与独活寄生汤含药血清组相比,PINK1 siRNA+独活寄生汤含药血清组细胞线粒体自噬水平降低(P<0.05),NLRP3和白细胞介素1β表达水平升高(P<0.05)。④结果表明,独活寄生汤通过调控PINK1/Parkin信号通路抑制NLRP3炎性小体活化,进而对痛风性关节炎起到治疗作用。

氧化苦参碱通过COX-2/PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬对MG63骨肉瘤细胞的促凋亡机制

目的基于环氧合酶2(COX-2)/PTEN诱导激酶1(PINK1)/帕金森病蛋白2(Parkin)信号通路介导的线粒体自噬研究氧化苦参碱对人骨肉瘤MG63细胞的促凋亡机制。方法取MG63细胞经2.0、4.0、8.0 mg/mL的氧化苦参碱和6μmol/L的5-氟尿嘧啶(5-FU)作用后,检测细胞凋亡率、凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]表达水平、线粒体膜电位降低比例、线粒体自噬水平以及PINK1、Parkin、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白表达水平。采用PINK1小干扰RNA(PINK1 siRNA)干扰PINK1的表达,将细胞分为对照组、PINK1 siRNA组、氧化苦参碱组、PINK1 siRNA+氧化苦参碱组,检测细胞中PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ蛋白表达水平和线粒体膜电位降低比例以及细胞凋亡率。采用慢病毒感染使COX-2过表达,将细胞分为对照组、氧化苦参碱组、COX-2组、COX-2+氧化苦参碱组,检测细胞中COX-2、PINK1和Parkin蛋白表达水平以及线粒体膜电位降低比例。结果经氧化苦参碱干预后,细胞凋亡率,Bax、PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ蛋白表达水平,线粒体自噬水平和线粒体膜电位降低比例均显著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与氧化苦参碱组比较,PINK1 siRNA+氧化苦参碱组细胞中PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ蛋白表达水平和细胞凋亡率以及线粒体膜电位降低比例均显著降低(P<0.05)。与氧化苦参碱组比较,COX-2+氧化苦参碱组细胞中COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),PINK1、Parkin蛋白表达水平和线粒体膜电位降低比例均显著降低(P<0.05)。结论氧化苦参碱可通过抑制COX-2表达,介导线粒体自噬信号通路PINK1/Parkin的过度活化,从而促进骨肉瘤细胞凋亡。

血管性帕金森综合征患者线粒体自噬信号通路PINK1/Parkin表达及其与神经功能的关系

目的探讨血管性帕金森综合征(VP)患者血清线粒体自噬信号通路PTEN诱导假定激酶1(PINK1)/Parkin相关蛋白的变化,及其对神经功能的作用。方法选取2020年3月—2022年5月河北北方学院附属第一医院VP患者55例(VP组)、健康志愿者55名(正常对照组)。检测所有研究对象PINK1和Parkin蛋白水平。选取30只SD大鼠,分为对照大鼠组(15只)和VP大鼠组(15只)。采用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)构建VP大鼠模型,对照大鼠注射等量0.9%NaCl溶液,模型构建成功24 h后采用流式细胞术检测各组大鼠脑组织细胞的存活率、早期凋亡率和晚期凋亡率,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹法检测大鼠脑组织自噬基因PINK1、Parkin mRNA和蛋白表达情况,同时检测PINK1/Parkin信号通路相关蛋白磷酸化修饰水平[磷酸化PTEN诱导假定激酶1(p-PINK1)蛋白和磷酸化Parkin(p-Parkin)蛋白]。采用透射电镜原位验证大鼠脑组织超微结构的变化情况,并采用免疫印迹法检测自噬蛋白[自噬相关蛋白(ATG)4、ATG7]和凋亡蛋白(Bcl-2、Bax)的相对表达量。结果VP组血清PINK1和Parkin水平显著高于正常对照组(P<0.05)。与对照大鼠组比较,VP大鼠组脑组织细胞存活率显著降低(P<0.01),细胞早期凋亡率和晚期凋亡率显著升高(P<0.01);PINK1 mRNA和Parkin mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),PINK1蛋白、Parkin蛋白、p-PINK1蛋白和p-Parkin蛋白相对表达量均显著升高(P<0.01)。透射电镜分析结果显示,VP大鼠组出现明显的细胞自噬和线粒体自噬损伤。与对照大鼠组比较,VP大鼠组脑组织Bcl-2蛋白相对表达量降低(P<0.001),Bax蛋白、ATG4蛋白和ATG7蛋白相对表达量均升高(P<0.01)。结论VP会引起脑组织细胞自噬增加,并加重线粒体自噬损伤,与脑组织PINK1/Parkin信号通路的过度激活有关。

烟酰胺单核苷酸通过Sirt3减轻心脏死亡供肝诱导的缺血-再灌注损伤

目的 探讨烟酰胺单核苷酸(NMN)对大鼠心脏死亡供肝诱导的缺血-再灌注损伤(IRI)的作用及机制。方法 通过“磁环+双袖套”法建立大鼠原位肝移植模型。将SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、原位肝移植组(OLT组)、NMN处理+原位肝移植组(NMN组)、NMN+去乙酰化酶-3(Sirt3)抑制剂(3-TYP)+原位肝移植组(NMN+3-TYP组)。观察各组大鼠肝组织病理学改变及肝细胞凋亡情况,检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平,测定肝组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量,检测肝组织Sirt3、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ、PTEN诱导假定激酶1(PINK1)、Parkin、线粒体外膜转位酶20(TOMM20)表达水平。分析各组大鼠术后生存情况。结果 与Sham组比较,OLT组ALT、AST水平升高;与OLT组比较,NMN组ALT、AST水平均下降;与NMN组比较,NMN+3-TYP组ALT、AST水平升高(均为P<0.05)。Sham组大鼠肝组织结构基本正常;OLT组大鼠肝组织可见明显的淤血、空泡变性和肝细胞坏死等病理改变。OLT组Suzuki评分、细胞凋亡率较Sham组升高;NMN组Suzuki评分、细胞凋亡率较OLT组降低;NMN+3-TYP组Suzuki评分、细胞凋亡率较NMN组升高(均为P<0.05)。与Sham组比较,OLT组SOD含量下降,MDA含量升高;与OLT组比较,NMN组SOD含量升高,MDA含量下降;与NMN组比较,NMN+3-TYP组SOD含量下降,MDA含量升高(均为P<0.05)。与Sham组比较,OLT组Sirt3、TOMM20蛋白相对表达量下降,PINK1、Parkin、LC3Ⅱ蛋白相对表达量升高;与OLT组比较,NMN组Sirt3、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ蛋白相对表达量升高,TOMM20蛋白相对表达量下降;与NMN组比较,NMN+3-TYP组PINK1、Parkin、LC3Ⅱ蛋白相对表达量下降,TOMM20蛋白相对表达量升高(均为P<0.05)。Sham组、OLT组、NMN组、NMN+3-TYP组大鼠术后7 d生存率分别为100%、50%、75%、58%。结论 NMN可通过上调Sirt3,增强肝脏抗氧化能力及诱导PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,减轻肝IRI,从而对心脏死亡供肝发挥保护作用。

暖巢煲调控线粒体功能改善早发性卵巢功能不全的实验研究

目的探讨暖巢煲调控卵巢线粒体功能治疗化疗性早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)损伤小鼠,为其临床应用提供科学依据。方法从40只8周龄雌性C57BL/6小鼠中抽取8只为空白组,其余构建POI模型。将成功建模的32只小鼠随机分为模型组、暖巢煲低剂量组、暖巢煲中剂量组、暖巢煲高剂量组,每组8只。模型组、空白组予0.01 mL/g生理盐水灌胃。观察小鼠的一般状况、体质量和动情周期变化,给药3周后,称取各组小鼠卵巢湿质量,计算卵巢指数。ELISA法检测各组小鼠血清抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)水平,HE染色观察卵巢组织形态学变化,透射电镜观察线粒体的形态和结构,Western blot检测视神经萎缩蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)和PTEN诱导假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)的表达水平。结果与空白组比较,模型组进食量减少、毛色枯燥;体质量增长率下降(P<0.05);卵巢指数明显下降(P<0.01);动情周期紊乱;血清AMH下降(P<0.05);各级生长卵泡减少、闭锁卵泡明显增加;线粒体结构破坏严重、空洞化明显;OPA1及PINK1蛋白表达水平明显下调(P<0.01)。与模型组比较,暖巢煲高、中、低剂量组体质量增长率上升(P<0.05);暖巢煲中、低剂量组卵巢指数增加;动情周期逐渐规律;暖巢煲中、高剂量组血清AMH上升(P<0.05),小鼠的卵母细胞线粒体结构明显改善,OPA1及PINK1蛋白表达明显上调(P<0.01)。结论线粒体功能障碍可能是小鼠卵巢功能不全的机制之一,而暖巢煲能够调节卵巢线粒体功能,改善早发性卵巢不全,可能与其通过促进线粒体自我更新的动力过程有关。

基于PINK1/parkin信号转导通路研究灵芝孢子对糖尿病心肌损伤的保护作用

目的探讨灵芝孢子对糖尿病(DM)大鼠心肌损伤的保护作用及对PTEN诱导假定激酶(PINK)1/帕金森病蛋白(parkin)信号通路的作用机制。方法将40只雄性SD大鼠随机分成对照(NC)组、高脂高糖饮食(HFD)组、DM组和灵芝孢子(GLS)组各10只。12 w末,记录各组末次体质量及空腹血糖。麻醉处死大鼠后,采集心脏组织,计算心脏指数,并检测丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)含量。苏木素-伊红染色(HE)和马松(Masson)染色观察心脏病理学变化。Western印迹检测PINK1/parkin通路蛋白、自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白,免疫组织化学技术验证PINK1、parkin的表达水平,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色评估细胞凋亡情况。结果与NC组相比,HFD组体质量明显增加,DM组体质量明显减轻,血糖水平明显升高(P<0.05);HFD组和DM组心脏指数、MDA含量、PINK1、parkin、p-parkin、微管相关蛋白轻链(LC)3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2同源结构域蛋白抗体(beclin)1、Bcl-2相关X蛋白(Bax)/Bcl-2蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率及血管周围胶原含量明显增加,SOD活性、p62蛋白表达水平显著下降(均P<0.05)。与DM组相比,HFD组和GLS组体质量、SOD活性、p62蛋白表达水平明显增加,血糖水平、心脏指数、MDA含量、PINK1、parkin、p-parkin、LC3、beclin1、Bax/Bcl-2蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率、血管周围胶原含量明显降低(均P<0.05)。结论灵芝孢子可减轻DM大鼠心肌损伤,改善纤维化程度,具有良好的抗氧化活性,可逆转心肌细胞过度自噬,抑制细胞凋亡,其保护作用可能与下调PINK1/parkin信号通路有关。

PINK1/Parkin线粒体自噬通路在糖尿病血管病变中的研究进展

PTEN诱导假定激酶1(PINK1)/Parkin通路是研究线粒体自噬的热门、经典通路。内皮细胞的线粒体功能障碍是糖尿病血管病变发生发展的重要病理机制,而PINK1/Parkin介导的线粒体自噬作为一种重要的功能障碍的线粒体清除机制,对因糖尿病血管病变引起的内皮细胞线粒体功能障碍同样具有积极作用。该通路在高血糖的作用下会受到抑制,因此其在糖尿病血管病变中具有很大的研究价值,针对该通路进行调控的方法作为糖尿病血管病变新的治疗手段,值得深入研究。

miR-142和PINK1在癫痫患儿血清中的表达及其临床意义

目的探讨癫痫(EP)患儿血清miR-142、PTEN诱导假定激酶1(PINK1)的表达水平及临床意义。方法选取2019年3月至2021年4月期间我院神经内科收治的79例EP患儿为研究组,根据病情严重程度分为轻度EP组(n=40)、中度EP组(n=19)和重度EP组(n=20);另选取同期于我院保健科体检的83例健康儿童为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)法测定所有受试者血清miR-142、PINK1mRNA的表达水平;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-142、PINK1 mRNA对EP患儿的诊断价值;多因素Logistic回归分析血清miR-142、PINK1mRNA对EP的影响效应。结果与对照组比较,研究组患儿血清miR-142水平明显较高,血清PINK1mRNA水平明显较低(t值分别为12.880和9.460,P<0.05)。不同EP类型患儿血清miR-142、PINK1mRNA水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与轻度EP组比较,中度EP组、重度EP组患儿血清miR-142水平明显升高,血清PINK1mRNA水平明显降低(P<0.05);与中度EP组比较,重度EP组患儿血清miR-142水平明显升高,血清PINK1mRNA水平明显降低(P<0.05)。ROC曲线分析显示,miR-142、PINK1mRNA诊断EP患儿的曲线下面积(AUC)分别为0.845(95%CI:0.786~0.904)、0.791(95%CI:0.720~0.862),最佳诊断临界值分别为1.569、0.813,敏感度分别为78.2%、72.9%,特异性分别为84.5%、83.2%;二者联合检测诊断EP患儿的AUC为0.915(95%CI:0.870~0.960),敏感度为91.9%,特异性为82.7%。多因素Logistic分析显示,miR-142水平是影响EP发生的危险因素(OR=1.980,95%CI:1.119~3.502),PINK1mRNA水平是影响EP发生的保护因素(OR=0.892,95%CI:0.809~0.984)。结论EP患儿的血清miR-142呈高表达,PINK1呈低表达,二者均可作为EP诊断的辅助指标。

线粒体自噬-NLRP3炎症小体通路在新生大鼠缺血性脑损伤中的作用研究

目的探讨线粒体自噬-NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体通路对新生大鼠缺血性脑损伤的影响。方法将42只1周龄SD大鼠分为Sham组、脑缺血-再灌注损伤(CIRI)组、CIRI+二甲基亚砜(DMSO)组、CIRI+Mdivi-1组、CIRI+MCC950组、CIRI+Ac-YVAD-cmk组,每组7只。除Sham组外,其他各组采用单侧颈总动脉阻断法建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型。采用Londa法行神经行为障碍评分,HE染色观察海马体CA1区细胞形态,透射电子显微镜观察海马神经元超微结构,Western blot检测线粒体自噬和NLRP3炎症小体通路相关蛋白。结果与CIRI+DMSO组比较,CIRI+Mdivi-1组的神经行为障碍评分增加,突触数减少及肿胀线粒体数增多(均P<0.05);与CIRI+Mdivi-1组比较,CIRI+MCC950组及CIRI+Ac-YVAD-cmk组神经行为障碍评分降低,突触数增多及肿胀线粒体数减少(均P<0.05)。与CIRI+DMSO组比较,CIRI+Mdivi-1组PTEN诱导的激酶1(PINK1)、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ表达下调,线粒体外膜转位酶20(TOMM20)、P62及NLRP3、胱天蛋白酶(caspase)-1、caspase-8蛋白表达增加(P<0.05)。与CIRI+Mdivi-1组比较,CIRI+MCC950组及CIRI+Ac-YVAD-cmk组PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达增加(P<0.05),CIRI+MCC950组NLRP3、caspase-1、caspase-8蛋白及CIRI+Ac-YVAD-cmk组caspase-1、caspase-8蛋白表达下调。结论激活线粒体自噬或抑制NLRP3炎症小体活化对新生大鼠缺血性脑损伤具有保护作用。

四磨汤口服液改善功能性消化不良模型大鼠的作用机制

目的 探讨四磨汤口服液调控PTEN诱导假定激酶1(Pink1)/E_(3)泛素连接酶(Parkin)轴对功能性消化不良(FD)模型大鼠的改善作用及机制。方法 取SD雄性大鼠,利用不可预知的慢性应激法建立FD模型,然后随机分为模型组、阳性对照组(多潘立酮片,3.5 mg/kg)、四磨汤组(四磨汤口服液,5.4 mL/kg),另设不造模的空白组,每组20只。各给药组大鼠灌胃相应药物,空白组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水,每天1次,持续14 d。末次给药结束后,检测大鼠胃排空率和小肠推进率;检测大鼠血清中胃肠激素[胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)、胆囊收缩素(CCK)]含量;观察大鼠胃窦组织中卡哈尔间质细胞(ICC)线粒体结构;观察大鼠胃窦组织中细胞色素C氧化酶Ⅳ(COXⅣ)和Parkin在线粒体中的共定位表达;检测大鼠胃窦组织中微管相关蛋白轻链3(LC3)、p62、Pink1、Parkin蛋白的表达。结果 与空白组比较,模型组大鼠胃排空率、小肠推进率和血清中MTL、GAS含量以及p62蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),血清中CCK含量和胃窦组织线粒体中COXⅣ、Parkin的共定位表达以及LC3、Pink1、Parkin蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);胃窦组织中ICC线粒体数量减少,线粒体空泡化,线粒体嵴模糊,自噬溶酶体较多。与模型组比较,阳性对照组和四磨汤组大鼠上述指标水平均显著逆转(P<0.05);ICC线粒体结构逐渐恢复,线粒体嵴清晰,自噬溶酶体减少。结论 四磨汤口服液可改善FD模型大鼠的胃肠动力和胃肠激素水平,其作用机制可能与抑制Pink1/Parkin轴、阻断自噬有关。

TANK结合激酶1在PINK1/Parkin依赖性和非依赖性线粒体自噬中的作用研究进展

线粒体自噬是一种清除受损或多余线粒体的过程,在调节细胞内线粒体质量和维持线粒体能量代谢等方面发挥重要作用。TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,同时参与调控PTEN诱导假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)/Parkin依赖性和非依赖性线粒体自噬过程。近期研究表明,TBK1可磷酸化视神经蛋白(optineurin,OPTN)、p62/sequestosome-1、Ras相关GTP结合蛋白7(Ras-related GTP binding protein 7,Rab7)等自噬相关蛋白,并介导核点蛋白52(nuclear dot protein 52,NDP52)与UNC-51样自噬激活激酶1(UNC-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)复合物相结合,以及TAX1结合蛋白1(TAX1-binding protein 1,TAX1BP1)与微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)相结合,从而增强PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬。TBK1亦可作为AMP活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)/ULK1自噬通路的作用底物而被激活,再通过磷酸化动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、Rab7促进PINK1/Parkin非依赖性线粒体自噬。本文对TBK1在PINK1/Parkin依赖性和非依赖性线粒体自噬中的作用及机制进行了综述。

槲皮素通过PINK1/parkin通路激活线粒体自噬减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

目的:分析槲皮素对脑缺血再灌注(I/R)损伤大鼠PTEN诱导激酶1(PINK1)/帕金蛋白(parkin)线粒体自噬通路的调控作用,探究其减轻大鼠脑缺血损伤的作用机制。方法:将60只SD雄性大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(I/R组)、槲皮素组、三甲基腺嘌呤(3-MA)组和槲皮素+3-MA组。各组均在造模前3 d开始给药,每天1次,末次给药30 min后,除sham组外,其余各组均采用四血管阻断法建立大鼠全脑I/R模型。各组大鼠均在造模结束后当天,用神经功能缺损评分(NDS)评价神经功能;采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测脑梗死体积;透射电镜观察海马组织线粒体形态变化;ELISA检测海马组织白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸缩合法检测检测海马组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;Western blot检测脑组织PINK1、parkin及LC3-Ⅱ蛋白的相对表达水平。结果:与sham组相比,I/R组和槲皮素+3-MA组大鼠海马组织可见线粒体肿胀、内部嵴破坏或消失等病理损伤,脑梗死体积、海马组织IL-6、TNF-α和MDA含量及PINK1、parkin和LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高(P<0.05),NDS评分及SOD活性降低(P<0.05)。与I/R组和槲皮素+3-MA组相比,槲皮素组海马组织病理损伤程度减轻,脑梗死体积、海马组织IL-6、TNF-α和MDA含量均降低(P<0.05),NDS评分、SOD含量及PINK1、parkin和LC3-II蛋白表达水平均升高(P<0.05);3-MA组大鼠组上述指标与槲皮素组趋势相反。I/R组与槲皮素+3-MA组相比,上述指标的差异无统计学显著性(P>0.05)。结论:槲皮素可通过调控PINK1/parkin通路蛋白表达,激活线粒体自噬,减轻脑缺血灌注再损伤。

Drp1的调控对PINK1突变转基因果蝇的保护作用

帕金森病(PD)是以黑质致密部多巴胺神经元选择性减少和胞浆内路易小体的形成为特征的神经退行性疾病。研究发现,PTEN诱导激酶1(PINK1)基因突变导致家族性早发型帕金森病的发生。在转基因果蝇中,PINK1功能丢失导致间接飞行肌缺陷,线粒体结构、功能障碍,多巴胺神经元丢失。本研究在PINK1突变PD转基因果蝇中,进行发动蛋白相关蛋白1(Drp1)过表达和敲低,探索Drp1对PD转基因果蝇的保护作用及其可能机制。本研究选用MHC-Gal4/UAS系统的PD转基因果蝇模型,特异性启动PINK1B9基因于果蝇肌肉组织中表达;运用Drp1基因过表达和RNA干扰干预PINK1B9转基因果蝇,研究其对PD转基因果蝇的作用。结果显示,不论过表达Drp1还是Drp1敲低均可挽救PINK1突变转基因果蝇,降低翅膀异常率,改善飞行能力,恢复间接飞行肌排列,调节线粒体形态,提高ATP生成量,上调NDUFS3蛋白表达水平。本文结果提示,Drp1的调控挽救PINK1突变转基因果蝇与线粒体呼吸链有关。

PINK1通过磷酸化HDAC3对弥漫大B细胞淋巴瘤CD20表达的影响

目的探究PTEN诱导激酶(PINK1)通过磷酸化组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)CD20表达的影响。方法采集DLBCL细胞系OCI-Ly7,取部分随机分为对照组,sh-PINK1组、sh-Con组,其中对照组细胞不作任何处理,sh-PINK1组细胞予以PINK1敲低处理,sh-Con组作抑制对照。比较各组细胞中PINK1、CD20 mRNA表达水平、HDAC3、p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平;分离sh-PINK1组、sh-Con组细胞质及细胞核,比较个两组细胞质及细胞核中PINK1、p-HDAC3 Ser424、CD20蛋白表达水平。取余下OCI-Ly7细胞系随机分为DMSO组、RGFP966组、Con组,其中Con自细胞不作处理,而RGFP966组细胞采用10μM HDAC3特异性抑制剂RGFP966处理24小时,DMSO组细胞作抑制剂对照。比较各组细胞中CD20蛋白表达水平。结果Sh-PINK1组细胞PINK1mRNA及蛋白表达水平显著低于对照组,CD20mRNA及蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。Sh-Con组细胞PINK1、CD20mRNA及蛋白表达水平与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。Sh-PINK1组细胞p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05)。Sh-Con组细胞p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。在细胞核中,sh-PINK1组PINK1、p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平均显著低于对照组(P<0.05)。在细胞质中,sh-PINK1组CD20蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。RGFP966组OCI-Ly7细胞CD20蛋白表达水平显著高于Con组(P<0.05)。Con组OCI-Ly7细胞CD20蛋白表达水平与DMSO组相比差异无显著性(P>0.05)。结论在弥漫大B细胞淋巴瘤中,细胞核PINK1可磷酸化HDAC3的Ser424位点进而激活HDAC3,最终达到转录抑制CD20表达的作用,而敲低PINK1表达或阻断HDAC3表达可显著促进CD20表达。