腹腔镜下射频消融联合静脉化疗对PTEN通路和Wnt通路介导肝癌细胞生长的影响

目的探讨腹腔镜下射频消融术(LRFA)联合静脉化疗对PTEN通路、Wnt通路介导肝癌细胞生长的影响。方法收集2013年5月-2016年6月该院收治的肝细胞癌患者90例,按照随机数表法分为观察组(n=45)及对照组(n=45)。观察组患者接受LRFA联合静脉化疗,对照组患者仅接受静脉化疗。术后1周取两组患者的肝脏病灶组织标本,采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测其中PTEN信号通路、Wnt信号通路相关基因m RNA表达量;采用放射免疫法检测血清肿瘤标志物含量。结果治疗1周后,观察组患者的病灶组织PTEN通路相关基因PTEN mRNA表达量高于对照组患者,缺氧诱导因子-1(HIF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达量低于对照组患者,差异有统计学意义(P<0.05);观察组患者的病灶组织Wnt通路相关基因β-链蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、c-myc和基质金属蛋白酶7(MMP-7)mRNA表达量低于对照组患者,差异有统计学意义(P<0.05);观察组患者的血清肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、γ-谷胺酰转肽酶同工酶Ⅱ(GGT-Ⅱ)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、糖类抗原19-9(CA19-9)含量低于对照组患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LRFA联合静脉化疗可通过PTEN通路、Wnt通路抑制肝癌细胞生长,具有积极的临床意义。

葛根素通过PTEN/AKT通路促进结直肠癌细胞自噬和凋亡的机制研究

目的:探讨葛根素通过PTEN/AKT通路促进结直肠癌细胞自噬和凋亡的作用及机制。方法:培养结直肠癌细胞株HCT-116、SW480,用不同浓度葛根素处理后检测细胞活力,筛选出适合浓度的葛根素处理细胞,检测细胞克隆形成、迁移、侵袭及凋亡的变化,Western Blot检测PTEN/AKT通路及自噬和凋亡相关蛋白的表达。结果:与对照组比较,250~2 000μmol/L的葛根素均能显著抑制HCT116、SW480细胞株的细胞活力(P<0.01)。采用500、1 000μmol/L的葛根素处理HCT116、SW480细胞,与对照组比较,葛根素各组细胞的克隆形成能力、迁移率、侵袭能力均显著降低,凋亡率及PTEN、cleaved Caspae-3、Beclin1蛋白表达显著升高,Bcl-2、p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:葛根素具有抑制结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及促进自噬和凋亡的作用,其促进细胞自噬和凋亡的机制与提高PTEN表达进而抑制AKT通路激活有关。

阿魏酸通过调节PTEN/PI3K/AKT信号通路抑制急性T淋巴细胞白血病进展

目的探究阿魏酸是否可通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路在体内外抑制急性T淋巴细胞白血病进展。方法将急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞分为对照组、阿魏酸处理组和LY294002处理组进行体外实验,对照组正常培养;阿魏酸处理组分别给予不同浓度(1.25、2.5、5、10、20、40、80、160µmol/L)阿魏酸,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,筛选实验浓度;LY294002处理组给予50µmol/L PI3K/AKT抑制剂LY294002,采用克隆形成实验、流式细胞术、Transwell实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭情况,采用Western blot检测核蛋白Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白相对表达量。使用30只雄性BALB/c裸鼠建立移植瘤裸鼠模型,平均分为正常组和阿魏酸处理组进行体内实验,正常组接种Jurkat细胞后以生理盐水灌胃,阿魏酸处理组接种Jurkat细胞后以75 mg/kg阿魏酸灌胃,比较移植瘤质量和体积变化,并检测肿瘤组织中Ki67、cleaved caspase-3/caspase-3、E-cadherin、N-cadherin、PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT水平。结果体外实验中,与对照组比较,5、10、20µmol/L阿魏酸处理组和LY294002处理组细胞克隆形成率、细胞侵袭数、Ki67、PCNA、N-cadherin、Vimentin、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT明显降低/减少(P<0.05),细胞凋亡率、cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9、E-cadherin、PTEN明显升高(P<0.05)。体内实验中,与正常组比较,阿魏酸处理组裸鼠肿瘤质量减轻,肿瘤体积减小,肿瘤组织中Ki67、N-cadherin、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT明显降低,cleaved caspase-3/caspase-3、E-cadherin、PTEN明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论阿魏酸在体内外均可抑制急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞的增殖及侵袭,并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与调控PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。

加味沙参麦冬汤调控PTEN/PI3K/AKT通路对CAG大鼠的治疗作用

目的观察加味沙参麦冬汤对慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠胃黏膜细胞凋亡及对PTEN/PI3K/AKT通路的作用。方法将60只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、加味沙参麦冬汤低剂量、中剂量、高剂量组共6组,每组各10只。除空白组外,其余大鼠饮用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液以复制CAG模型。阳性对照组以维酶素作为阳性对照,于造模完成后给予0.3 g/kg维酶素混悬液灌胃,加味沙参麦冬汤低剂量、中剂量、高剂量组分别给予加味沙参麦冬汤不同剂量灌胃,每日给药1次,持续12周。采用中性红清除法观察胃黏膜血流量,ELISA实验检测血清中Fas、Fas L的含量,TUNEL染色检测胃黏膜细胞凋亡情况,免疫组织化学法及Western-blot法检测胃黏膜组织中PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。结果加味沙参麦冬汤不同剂量灌胃治疗后,胃黏膜血流量明显升高,血清中Fas、Fas L的水平显著降低,胃黏膜TUNEL凋亡阳性细胞明显减少,胃黏膜组织中AKT的阳性细胞数和蛋白表达显著减少(P<0.05),胃黏膜组织中PTEN的阳性细胞数和蛋白表达显著上调,PI3K的阳性细胞数和蛋白表达显著下调(P<0.05),且效果呈现剂量依赖性。结论加味沙参麦冬汤对CAG大鼠具有较好的治疗效果,能够通过抑制细胞过度凋亡保护黏膜上皮,同时通过增加PTEN的表达有效抑制PI3K/AKT信号通路的异常激活,发挥对CAG的防治作用。

DJ-1过表达通过PTEN/Akt通路促进人胃癌MGC803细胞的增殖、迁移、侵袭与上皮间质转化

目的:探讨DJ-1基因过表达对人胃癌MGC803细胞增殖、迁移、侵袭与上皮间质转化(EMT)的影响及其机制。方法:利用基因转染技术构建DJ-1基因过表达MGC803细胞,实验分为MGC803、空载体和DJ-1过表达组。采用MTT、平板克隆形成、细胞划痕和Transwell实验分别检测DJ-1过表达对MGC803细胞增殖、克隆形成、迁移与侵袭的影响;qPCR和WB法检测DJ-1过表达对各组细胞DJ-1、PTEN、Akt、p-Akt、Snail、vimentin、E-cadherin、MMP-9与TIMP-3表达的影响,相差显微镜下观察MGC803细胞形态学的变化。裸鼠荷瘤实验检测DJ-1过表达对MGC803细胞移植瘤体内生长的影响。结果:成功构建DJ-1基因稳定过表达的MGC803细胞。与MGC803组和空载体组比较,DJ-1过表达组细胞的增殖能力与克隆形成数均显著增加(均P<0.05),细胞迁移距离明显增加、划痕距离明显缩短(均P<0.05),迁移与侵袭细胞数显著增多(均P<0.05),DJ-1 mRNA与蛋白表达明显上调、PTEN mRNA与蛋白表达下调(均P<0.05),Akt总蛋白各组比较无明显差异(均P>0.05),p-Akt蛋白表达明显上调(P<0.05),Snail、vimentin与MMP-9表达上调、E-cadherin与TIMP-3表达下调(均P<0.05)。相差显微镜下见长梭形细胞数目增多,圆形与椭圆形细胞减少,异型性更为明显。荷瘤裸鼠体内实验结果表明,与MGC803组相比较,DJ-1过表达组MGC803细胞移植瘤生长速度明显加快、移植瘤质量显著增加(均P<0.05)。结论:DJ-1过表达可通过PTEN/Akt通路在体内外抑制MGC803细胞的增殖、迁移、侵袭与EMT。

过表达CBX7调控PTEN/Akt信号通路干预上皮-间充质转化抑制胃癌细胞迁移、侵袭

目的探讨染色体盒蛋白同源物7(CBX7)对胃癌细胞上皮-间充质转化(EMT)、迁移、侵袭的影响及相关作用机制。方法将CBX7过表达质粒和阴性对照质粒、CBX7 siRNA和阴性对照siRNA转染至体外培养的人胃癌细胞SGC7901。采用qRT-PCR和Western blot法检测细胞中CBX7的mRNA和蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,Transwell小室检测细胞侵袭情况,Western blot法检测细胞中EMT相关蛋白和磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关蛋白表达。结果与pcDNA-NC组比较,pcDNA-CBX7组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数均显著下降/减少,细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、PTEN蛋白表达量均显著升高,N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)蛋白表达量、p-Akt/Akt均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CBX7组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数均显著升高/增加,细胞中E-cadherin、PTEN蛋白表达量均显著下降,N-cadherin、Vimentin蛋白表达量和p-Akt/Akt均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达CBX7可通过抑制EMT进程抑制胃癌细胞迁移、侵袭,其作用机制可能与调控PTEN/Akt信号通路有关。

Notch/PTEN/AKT信号通路在跑台运动减轻db/db小鼠肾纤维化中的作用及机制研究

目的:探讨运动对2型糖尿病模型db/db小鼠肾损伤的保护作用及机制。方法:将8周龄的雄性db/db小鼠随机分为4组:db/db组(n=8)、db/db+跑台运动(Exe)组(n=7)、db/db+Exe+Notch抑制剂二苯并氮䓬(DBZ)组(n=7)和db/db+DBZ组(n=6);同月龄雄性m/m小鼠作为阴性对照(Con)组(n=10)。db/db+DBZ组和db/db+Exe+DBZ组小鼠进行DBZ干预(灌胃8周,每周5 d,0.04 mg/kg),db/db+Exe组和db/db+Exe+DBZ组小鼠进行跑台运动(运动8周,每周5 d;db/db+Exe+DBZ组小鼠在灌胃2 h后进行运动)。HE染色和PAS染色评价肾组织形态学变化;Masson染色观察肾组织纤维化程度;试剂盒检测血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)水平;Western blot检测肾组织纤维化指标、Notch/PTEN/AKT信号通路相关蛋白和自噬相关蛋白的表达。结果:(1)与Con组相比,db/db组小鼠体重和血糖显著升高(P<0.01),运动干预后显著降低(P<0.05)。(2)与Con组相比,db/db组小鼠BUN和SCr水平显著升高(P<0.01),组织学染色显示肾组织损伤加重,运动干预后BUN和SCr水平均显著降低(P<0.01),肾组织损伤减轻。(3)Western blot结果显示,与db/db组相比,db/db+Exe组I型胶原(Col-I)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达显著减少(P<0.05),Col-Ⅲ和转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))表达有下降趋势,免疫荧光显示小鼠肾脏中α-SMA、Col-I和纤连蛋白荧光染色阳性信号显著减弱;db/db+DBZ组TGF-β_(1)蛋白表达下降(P<0.01);db/db+Exe+DBZ组Col-I、α-SMA、Col-Ⅲ和TGF-β_(1)蛋白表达有下降趋势,但差异无统计学意义。(4)与db/db组相比,db/db+Exe组和db/db+DBZ组Notch1、Hes1和Hey1表达水平及p-AKT/AKT比值均显著降低(P<0.05),PTEN蛋白表达上调(P<0.05),而db/db+Exe+DBZ组Notch1、Hes1、Hey1和p-AKT/AKT蛋白表达无显著差异,PTEN蛋白显著升高(P<0.01)。(5)与db/db组相比,db/db+Exe组和db/db+DBZ组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高(P<0.01),p62表达显著减少(P<0.01);db/db+Exe+DBZ组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P<0.01),p62表达无显著差异。(6)与db/db+DBZ组相比,db/db+Exe组Hey1蛋白下调(P<0.05);与db/db+Exe组相比,db/db+Exe+DBZ组PTEN蛋白上调(P<0.01)。结论:运动减轻db/db小鼠肾功能损伤和肾纤维化,其机制可能与其抑制Notch/PTEN/AKT信号通路而促进细胞自噬有关。

紫草素诱导慢性髓系白血病细胞增殖抑制和凋亡的PTEN信号通路研究

目的:探讨紫草素对慢性髓系白血病K562细胞的作用及其可能机制。方法:体外培养慢性髓系白血病K562细胞,分组为对照组和紫草素10μmol/L组、紫草素30μmol/L组、紫草素50μmol/L组,分别培养12、24、48、72h后,MTT法检测细胞增殖抑制率,Annexin V FITC/PI染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡率,同时用MTT法观察紫草素对K562细胞生长的影响;Western blot检测细胞内PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表达。结果:紫草素能有效抑制K562细胞增殖,促进细胞凋亡,上调细胞PTEN蛋白表达量,下调p-PI3K和p-Akt蛋白表达量,各浓度间差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论:紫草素能通过调控PTEN、p-PI3K、p-Akt信号通路抑制K562细胞的增殖,促进其凋亡。

槲皮素通过PTEN/PI3K/JNK信号通路减轻小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症

目的:探讨槲皮素(quercetin,Que)对细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠巨噬细胞炎症模型的抗炎效应及其与第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信号通路联合抗炎的效果和机制。方法:以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象。采用CCK-8实验确认0~100μmol/L Que的安全实验浓度。将细胞分为对照组、LPS炎症细胞模型组(LPS组)和不同浓度的Que处理LPS炎症细胞模型组(Que组)。Griess法检测各组细胞内一氧化氮(nitric oxide,NO)的分泌;ELISA法检测各组细胞上清液中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光法检测Que对各组细胞内PTEN/PI3K和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路蛋白的调节作用;利用PI3K抑制剂LY294002及PTEN外源过表达质粒探索Que与PI3K/PTEN的联合抗炎作用。结果:(1)对比LPS组,Que呈浓度依赖性地降低RAW264.7细胞内NO的分泌(P<0.05);(2)Que能显著降低LPS引起的iNOS、IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA表达(P<0.05);(3)与LPS组相比,Que组PTEN蛋白表达显著升高(P<0.05),p-PI3K和p-AKT及p-JNK的蛋白水平显著下降(P<0.05);(4)LY294002的作用证实Que在RAW264.7细胞内抑制炎症反应与调控PI3K信号通路有关;(5)PTEN过表达实验证实PTEN可增强Que在RAW264.7细胞内的抗炎作用。结论:(1)Que在体外培养的小鼠RAW264.7细胞内具有抗炎活性,其机制与活化PTEN的表达、阻断PI3K/AKT及JNK信号通路有关。(2)PTEN可增强Que在RAW264.7细胞内的抗炎能力。

RSRC1通过靶向调控PTEN/PI3K/AKT通路抑制食管鳞状细胞癌的增殖和转移

目的 探索富含精氨酸和丝氨酸的卷曲螺旋1(RSRC1)在食管鳞状细胞癌(ESCC)增殖和转移中的作用。方法 通过生信分析检测磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)在ESCC中的表达。利用qRT-PCR和蛋白免疫印迹法检测ESCC细胞中RSRC1的表达。通过CCK-8、细胞迁移和侵袭实验阐明RSRC1对ESCC细胞增殖和转移的作用。通过蛋白免疫印迹法分析PTEN/PI3K/AKT信号通路相关因子的表达。结果 生信分析结果显示PTEN在ESCC组织中低表达。分子实验显示RSRC1在ESCC细胞中低表达。细胞实验发现敲低RSRC1可促进ESCC增殖和转移,并且可以调节PTEN/PI3K/AKT信号通路。结论 RSRC1通过靶向调控PTEN/PI3K/AKT通路抑制ESCC的增殖和转移,RSRC1可能是一种新的ESCC诊断标志物和治疗靶点。

正肝方对二乙基亚硝胺诱导的肝癌前病变模型大鼠肝组织PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响

目的观察正肝方对二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)诱导的肝癌前病变大鼠的生化指标和PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响,探讨其对肝癌前病变大鼠的作用机制。方法将80只大鼠按照随机数字表法分为5组:空白对照组、DEN模型组、正肝方低、中、高剂量组(2 g/kg、4 g/kg、8 g/kg),每组各16只。为建立肝癌前病变大鼠模型,除空白组外,其余各组大鼠连续16周每周1次腹腔注射DEN(50 mg/kg)。同时,从造模第1周开始,空白对照组及模型组灌喂纯水10 ml/kg,正肝方低、中、高剂量组分别灌喂相应剂量的正肝方药液,1次/d,连续灌胃至第16周。禁食不禁水16 h后测量大鼠体质量,麻醉,心脏取血,称量肝脏、胸腺重量。全自动生化法检测肝功能指标,包括丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、白蛋白(Albumin,ALB)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT);HE染色观察肝组织病理改变,免疫组化和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测肝组织中甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)的阳性表达水平,蛋白质免疫印迹法检测肝组织中PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平。结果与正常组比较,DEN模型组大鼠体质量明显降低,肝脏指数增加,胸腺指数下降,肝功能指标除ALB外均明显升高,HE染色可见模型组肝细胞出现不同程度的变性、坏死、排列紊乱、细胞多形性等癌前病变表现,肿瘤组织中AFP、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平明显升高,PTEN蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01);与DEN模型组比较,正肝方中、高剂量组肝脏指数均有降低,高剂量组较为明显,差异有统计学意义(P<0.05),各组胸腺指数表现出不同程度升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.001),血清ALT、ALP、GGT水平降低,ALB升高,肿瘤变性坏死区减少,AFP、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05),PTEN蛋白表达水平提高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论正肝方可改善肝功能指标和肝癌前病变状况,提高机体免疫力和PTEN抑癌蛋白的表达水平,降低组织中AFP、p-PI3K、p-AKT等癌症蛋白的表达,其机制可能与抑制PTEN/PI3K/AKT通路的激活,从而抑制癌前病变的发生发展相关。

基于PI3K/PTEN/Akt信号通路探讨Hp阳性萎缩性胃炎的作用机制

目的基于磷脂酰肌醇3-激酶/第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物/蛋白激酶B(PI3K/PTEN/Akt)信号通路探讨幽门螺旋杆菌(Hp)阳性萎缩性胃炎(CAG)的发生机制。方法70只Wistar大鼠,随机取50只用Hp感染联合水杨酸钠乙醇灌胃的方法建立Hp阳性CAG大鼠模型,剩余20只健康大鼠作为对照组。取对照组、模型组大鼠各10只为对照1组、模型组,检测胃液分泌量、胃蛋白酶活性;血清胃泌素(GAS)、胃蛋白酶原(PG)Ⅰ、PGⅡ水平;PI3K、PTEN、Akt蛋白表达;另取10只对照组大鼠为对照2组,另40只模型大鼠分为阴性对照(NC)组,PI3K基因沉默(sh-PI3K)组,Akt基因沉默(sh-Akt)组、PTEN过表达(miR-PTEN)组,分别通过尾静脉注射空白载体、PI3K-shRNA、Akt-shRNA及PTEN慢病毒载体调节PI3K、PTEN、Akt表达。8 w后检测大鼠胃液分泌量、胃蛋白酶活性;血清GAS、PGⅠ、PGⅡ水平;Hp检测胃组织Hp阳性率;检测胃黏膜组织凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-9表达变化。结果与对照1组比较,模型组胃蛋白酶活性明显降低,胃液分泌量明显减少,血清GAS含量、PGⅠ/PGⅡ比值明显降低,PTEN蛋白表达显著降低、PI3K、Akt蛋白表达显著升高;调节PI3K、Akt、PTEN表达后,模型组胃蛋白酶活性明显提高,胃液分泌量明显增加,血清PGⅠ/PGⅡ、GAS含量明显升高,Hp阳性率明显降低,胃黏膜组织凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9表达明显降低(P<0.05)。结论Hp阳性CAG大鼠存在PI3K、Akt、PTEN表达异常,调节PI3K、Akt、PTEN表达后可改善模型大鼠胃部病变,表明Hp阳性CAG的发生机制与PI3K/Akt/PTEN途径有关。

miR-10b-5p靶向JARID2及PTEN/Akt/PI3K信号通路调控人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和迁移能力

目的探讨miR-10b-5p靶向Jumonji富含AT结合结构域2(JARID2)及磷脂酶和张力蛋白同源物(PTEN)/蛋白激酶B(Akt)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路调控人乳腺癌M.D.Anderson和MB代表转移性乳腺癌-231(MDA-MB-231)细胞增殖和迁移的影响。方法培养人正常乳腺细胞密歇根癌症基金会-10A(MCF-10A)及人乳腺癌MDA-MB-231细胞,采用Real-time聚合酶链式反应(PCR)法检测两种细胞中miR-10b-5p表达。将MDA-MB-231细胞分为对照组(Lip2000处理后正常培养细胞)、上调拟似物组(Lip2000+miR-10b-5p拟似物mimic转染)、上调转染组(Lip2000+mimic-miR-10b-5p共转染)、下调拟似物组(Lip2000+miR-10b-5p拟似物inhibitor转染)、下调转染组(Lip2000+inhibitor-miR-10b-5p共转染)。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测各组细胞增殖情况,Transwell检测各组细胞迁移能力,Western blot法检测各组中JARID2及PTEN/Akt/PI3K信号通路蛋白表达。结果MDA-MB-231细胞中miR-10b-5p表达量高于MCF-10A细胞(P<0.05)。上调转染组增殖抑制率低于对照组,下调转染组增殖抑制率高于对照组(P<0.05);上调拟似物组和下调拟似物组增殖抑制率与对照组比较差异无统计学意义。上调转染组细胞数量少于对照组,下调转染组细胞数量多于对照组(P<0.05);上调拟似物组和下调拟似物组与对照组细胞数量比较差异无统计学意义。上调转染组JARID2、PTEN蛋白表达量均高于对照组,PI3K、Akt蛋白表达均低于对照组(P<0.05);下调转染组JARID2、PTEN蛋白表达量均低于对照组,PI3K、Akt蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。结论miR-10b-5p可靶向JARID2及PTEN/Akt/PI3K信号通路表达,影响人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和迁移能力。

miR-374a通过PTEN/AKT信号通路调节乳腺癌细胞增殖与凋亡作用分析

目的:探讨microRNA-374a(miR-374a)通过PTEN/AKT信号通路对乳腺癌细胞增殖与凋亡的调节作用。方法:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对人乳腺癌细胞MCF-7和正常乳腺细胞Hs 578Bst中的miR-374a和PTEN mRNA转录水平进行检测。此外,通过蛋白免疫印迹(Western blot)方法,测定MCF-7和Hs 578Bst细胞以及对照组和MiR-374a抑制剂处理组中PTEN和AKT及其磷酸化形式蛋白的表达变化。采用CCK-8法和TUNEL法,分别评估对照组和MiR-374a抑制剂处理组的细胞增殖和凋亡情况。同时,利用Western blot技术检测两组细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的表达变化。结果:在乳腺癌细胞中,MiR-374a的表达水平显著下调。通过转染技术抑制MiR-374a的表达后,乳腺癌细胞的增殖速率增快,凋亡率降低。同时,Western blot分析表明,抑制MiR-374a的表达导致PTEN蛋白水平下调,并伴随着AKT磷酸化水平的升高,从而激活PTEN/AKT信号通路。结论:MiR-374a通过靶向调节PTEN/AKT信号通路,对乳腺癌细胞的增殖和凋亡发挥重要的调节作用,为乳腺癌的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略。

益气活血汤通过miR-21/PTEN信号通路抑制肺癌细胞恶性生物学行为

目的:探讨益气活血汤(Yiqi Huoxue decoction)对肺癌细胞恶性生物学行为的抑制作用及其机制。方法:以不同浓度益气活血汤含药血清(5%、10%、15%)处理人肺癌A549细胞,CCK-8(Cell Counting Kit-8)法、Transwell小室实验、流式细胞术、Western blot法和定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)法研究益气活血汤含药血清对细胞增殖、迁移和侵袭能力、细胞凋亡、第10染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)蛋白和miR-21表达的影响。结果:与无药血清组相比较,不同剂量的益气活血汤含药血清处理后,A549细胞存活率降低、迁移和侵袭能力下降;细胞凋亡率上升、细胞内PTEN mRNA及其蛋白表达增加、miR-21表达下降,且10%含药血清组的效果最佳。转染miR-21 mimics后,A549细胞中miR-21表达上调,PTEN蛋白表达下调;10%含药血清处理后PTEN蛋白表达上调。结论:益气活血汤可有效抑制人肺癌A549细胞恶性细胞生物学行为,且可能与miR-21/PTEN信号通路的调控有关。

糖尿病大鼠肾组织中PTEN/AKT/mTOR通路对自噬的调控作用

目的:观察糖尿病大鼠肾组织中PTEN和自噬水平的变化,探讨糖尿病肾病中PTEN/AKT/m TOR通路对自噬的调控机制。方法:将SD大鼠随机分为正常对照组(NC组)和糖尿病组(DM组),每组各8只。用链脲佐菌素复制DM大鼠模型。于成模后10周处死大鼠后测定相应生化指标和肾脏指数,免疫组化观察肾小管上皮细胞PTEN蛋白的表达部位;Western blotting法检测肾组织LC3、PTEN及PTEN/AKT/m TOR通路的变化;realtime PCR检测肾组织PTEN的mRNA表达水平。结果:DM组的血糖、24 h尿蛋白量和肾脏指数均显著高于NC组(P<0.05)。与NC组相比,DM组大鼠肾组织的LC3I和LC3II水平明显降低(P<0.05)。PTEN主要分布于肾小管上皮细胞中,DM组PTEN蛋白的表达水平明显低于NC组(P<0.05)。DM大鼠肾组织中,PTEN/AKT/m TOR通路的活性增高。结论:糖尿病大鼠肾脏组织中细胞自噬水平下降,而参与自噬调控的PTEN/AKT/m TOR通路活性升高,提示其自噬水平的变化可能受到PTEN/AKT/m TOR通路的调节。

miR-21对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡及PTEN/AKT通路的影响

目的探讨miR-21对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡以及PTEN/AKT通路的影响。方法体外培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19,实验分为四组:空白对照组、阴性对照组、H2O2组、H2O2+miR-21mimics组,使用q-RT-PCR法检测各组ARPE-19细胞中miR-21表达,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3以及人第10号染色体缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)、磷酸化AKT蛋白表达。结果与空白对照组和阴性对照组相比,H2O2组和H2O2+miR-21 mimics组miR-21表达量(1.14±0.23、2.18±0.44)、SOD水平[(5.49±1.10) U·L^-1、(14.28±2.86) U·L^-1]、Bcl-2蛋白含量(0.34±0.07、0.62±0.12)、p-PI3K表达水平(0.46±0.09、0.68±0.13)、p-AKT水平(0.53±0.11、1.16±0.13)均显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05),而活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平(30.58±7.96、23.25±5.67)、MDA水平[(3.95±0.79)mol·L^-1、(2.13±0.43)mol·L^-1]、凋亡率[(25.48±5.10)%、(17.63±3.52)%]、PTEN蛋白表达(0.59±0.12、0.43±0.11)、Bax表达(0.73±0.15、0.49±0.10)、Caspase-3蛋白表达(0.85±0.17、0.42±0.08)均显著升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与H2O2组相比,H2O2+miR-21 mimics组miR-21表达量、SOD水平、Bcl-2蛋白表达、p-PI3K及p-AKT蛋白表达均显著升高(均为P<0.05),ROS水平、MDA水平、细胞凋亡率、PTEN蛋白表达、Bax及Caspase-3蛋白表达均显著降低(均为P<0.05)。结论上调miR-21可能通过激活PTEN/AKT信号通路抑制H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞细胞凋亡。

长链非编码RNA AFAP1-AS1通过PTEN/p-AKT信号通路调控结直肠癌细胞增殖的分子机制研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1(Actin filament-associatedprotein1-antisenseRNA1,AFAP1-AS1)调控结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)细胞增殖的分子机制。方法收集2014年7月—2018年6月深圳市第二人民医院消化内科和胃肠外科诊治的38例正常人及38例CRC患者的粪便标本,用Real time-PCR检测lncRNA AFAP1-AS1表达,同时检测人正常结肠上皮细胞株NCM460、人结直肠癌细胞株SW620和HCT116中lncRNA AFAP1-AS1的表达;将靶向siRNA转染到CRC细胞株SW620和HCT116中抑制AFAP1-AS1的表达;通过MTT测定si-AFAP1-AS1转染对CRC细胞增殖的影响;应用免疫印迹检测Cleaved caspase 3、Bcl-2、Bax、p-AKT、total-AKT和PTEN的水平。结果与正常人相比,CRC患者粪便中AFAP1-AS1的表达显著上升(P<0.01);与NCM460细胞相比,SW620和HCT116细胞中AFAP1-AS1的表达也显著升高(P<0.01);si-AFAP1-AS1转染抑制SW620和HCT116的细胞生长(P<0.01)。与NCM460细胞相比,si-AFAP1-AS1干扰上调了SW620和HCT116细胞中Cleaved caspase 3和促凋亡蛋白Bax的表达水平(P<0.05),下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P<0.001);此外,si-AFAP1-AS1干扰降低了CRC细胞中p-AKT的蛋白水平,并增加了PTEN的表达(P<0.01)。结论正常人和CRC患者粪便中lncRNA AFAP1-AS1表达的差异有助于CRC的早期诊断,且lncRNA AFAP1-AS1在CRC细胞中表达上调,并通过PTEN/p-AKT信号通路调节CRC细胞的增殖和凋亡。lncRNA AFAP1-AS1有望成为CRC早期诊断的分子靶标。

circRNA_0051079通过靶向miR⁃26a⁃5p/PTEN轴诱导视网膜神经变性的分子机制

目的探讨circ_0051079对缺血/再灌注(I/R)损伤诱导的视网膜神经变性的影响及机制。方法从C57BL/6J乳鼠眼球中分离视网膜神经节细胞(RGC),随机分为对照组、siRNA组(转染阴性siRNA)、si_circ_0051079组(转染si⁃circ⁃0051079干扰RNA)、模拟物对照组(转染Scr mimic)、miR⁃26a⁃5p组(转染miR⁃26a⁃5p mimic)、miR⁃26a⁃5p+vector组(转染pcDNA 3.1)、miR⁃26a⁃5p+PTEN组(转染pcDNA 3.1⁃PTEN),分别在正常、缺氧(体积分数1%O_(2)暴露)或氧化应激(50μmol·L^(-1) H_(2) O_(2)暴露)条件下培养24 h,进行RT⁃qPCR、CCK⁃8、TUNEL、RNA免疫沉淀(RIP)等检测。于15只C57BL/6小鼠左眼中建立I/R损伤模型,对侧眼保持正常眼压作为对照,I/R损伤后0 d、3 d和7 d各取5只小鼠收集视网膜检测circ_0051079表达。另取20只C57BL/6小鼠分为正常对照组(用针头插入左眼前房但不升高眼压)、I/R组(左眼I/R损伤处理)、I/R+对照shRNA组(左眼注射无序shRNA并建立I/R损伤模型)、I/R+circ_0051079 shRNA组(左眼注射circ_0051079 shR⁃NA并建立I/R损伤模型)。I/R损伤后7 d,取视网膜进行蛋白免疫荧光染色。收集2020年11月至2021年3月急性闭角型青光眼和白内障患者的房水样本各20例,进行RT⁃qPCR测定。结果缺氧或氧化应激条件下培养的RGC中circ_0051079表达量较正常条件下培养的RGC增加(均为P<0.05)。在缺氧或氧化应激条件下培养,si_circ_0051079组RGC细胞活力均较siRNA组增加,RGC凋亡细胞数均减少(均为P<0.05)。荧光素酶报告基因分析和RIP检测结果表明,circ_0051079可以通过调节miR⁃26a⁃3p/PTEN信号转导进而影响RGC功能。动物实验中,I/R损伤可致视网膜组织中circ_0051079表达量升高(P<0.05)。与正常对照组(1.00±0.07)相比,I/R+circ_0051079 shRNA组小鼠视网膜中circ_0051079表达水平(0.37±0.04)下降(P<0.05),同时I/R诱导的视网膜神经变性减轻。临床研究中,与白内障患者房水样本相比,青光眼患者房水样本中circ_0051079和PTEN mRNA表达增加,miR⁃26a⁃3p表达降低(均为P<0.001)。结论circ_0051079可能是缺血性视网膜病变诊断和治疗的潜在靶点。

姜黄素作用PTEN/PI3K/AKT通路诱导食管癌EC109细胞凋亡

目的：研究姜黄素作用食管癌的分子机制。方法：体外培养人食管癌细胞（EC109）,15~120μmol/L姜黄素处理后,采用CCK-8法检测姜黄素对细胞的增殖抑制作用,透射电镜观察细胞超微结构,Annexin V-FITC/PI双染激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡,流式细胞术分析15~120μmol/L姜黄素作用EC109细胞后PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白PTEN、AKT、GSK3β和Caspase 3的表达水平。结果：CCK-8检测结果姜黄素能显著抑制EC109细胞的增殖,呈剂量和时间效应关系;透射电镜和激光共聚集显微镜观察发现姜黄素能使EC109细胞发生凋亡;流式细胞仪蛋白水平分析显示姜黄素可增强细胞中PTEN、GSK3β和Caspase 3的表达,抑制AKT的表达。结论：姜黄素抑制EC109细胞的增殖并促进其凋亡的生物学效应与增强PTEN的表达抑制PI3K/AKT信号通路有关。