黄连-大黄-肉桂复方对肝癌细胞增殖及PTEN-PI3K-AKT/SGK1信号通路的影响

目的:观察黄连-大黄-肉桂复方对肝癌细胞增殖的抑制作用,并探索其作用机制。方法:采用醇提法提取黄连-大黄-肉桂复方药液,观察药物作用24 h后SMMC-7721人肝癌细胞株细胞形态的改变;通过MTT法检测不同浓度药物作用24 h、48 h和72 h对肝癌细胞增殖的影响;采用RTq PCR法检测肝癌细胞PTEN、AKT和SGK1基因的mRNA表达。结果:较低浓度的黄连-大黄-肉桂复方作用24 h对肝癌细胞的形态影响较小,而浓度增至2.1 mg/ml可使肝癌细胞部分固缩,大多细胞凋亡,其对肝癌细胞的恶性增殖具有显著抑制作用,并存在时效和量效关系,0.5 mg/ml药物作用48 h即可致肝癌细胞增殖半数得到抑制;药物作用后AKT mRNA表达明显降低,PTEN mRNA表达上调、SGK1 mRNA表达降低。结论:黄连-大黄-肉桂复方能有效抑制肝癌细胞的恶性增殖,且具有时效和量效关系;其抑制作用可能与调节细胞PTEN-PI3K-AKT/SGK1信号转导通路有关。

IGF1-PI3K-Akt信号通路相关基因在黄羽肉鸡肌肉和肝脏中的表达

【目的】IGF1-PI3K-Akt信号通路是调控生长发育的关键通路,选择慢速型的广西麻鸡和中速型的花山麻鸡作为研究对象,探究IGF1-PI3K-AKT信号通路相关基因胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factors, IGF1)、胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor receptor, IGF1R)和胰岛素受体底物1 (Insulin receptor substrate1, IRS1)在骨骼肌和肝脏中的发育性表达规律,为阐明黄羽肉鸡生长发育调控机理提供参考。【方法】采用SPSS20.0比较广西麻鸡和花山麻鸡在胚胎期至出生后早期的生长发育差异,采用实时荧光定量PCR方法检测上述3个基因在两个品种鸡胚胎期(9、12、16胚龄)和出生后(0、7、21、35、49和63日龄)胸肌、腿肌和肝脏中的表达差异,并将其与体重和组织重进行相关性分析。【结果】鸡生长发育早期体重、骨骼肌重和肝脏重变化呈现显著的品种和时间特异性,经过选育的花山麻鸡体重和组织重的增长在胚胎发育后期已经远远超过广西麻鸡。IGF1、IGF1R和IRS1基因表达存在显著的品种、组织和发育时段特异性,总体上,在胚胎期肌肉中的表达量高于肝脏组织,出生后则为肝脏中的表达量高于肌肉组织,广西麻鸡肌肉中的表达量高于花山麻鸡,而花山麻鸡肝脏中的表达量要高于广西麻鸡。IGF1基因在两个品种胸腿肌中均在9胚龄即可检测到表达,腿肌中表达量均是9胚龄时最高,除与12胚龄差异不显著外,与其他各阶段差异显著,表达量最低点出现在出雏0日龄时;胸肌中则是12胚龄时表达量最高,63日龄时最低;肝脏中则出现品种差异,广西麻鸡胚胎期未检测到表达,从出雏0日龄开始表达,表达高峰出现在21日龄时,而在花山麻鸡中虽然胚胎期检测到表达但表达量极低,49日龄时达到表达高峰。两品种鸡肌肉和肝脏各个阶段均检测到IGF1R mRNA的表达,在胸肌和腿肌中的表达量均表现为9胚龄最高,广西麻鸡9胚龄与其他各阶段差异显著,花山麻鸡9胚龄除与12胚龄差异不显著外,与其他各阶段均差异显著;肝脏中,广西麻鸡表达高峰出现在21日龄,且与9、12、16胚龄和0日龄差异显著,花山麻鸡则是63日龄时最高,与其他各阶段差异显著。两品种鸡肌肉和肝脏各个阶段均能检测到IRS1 mRNA的表达,在两品种肌肉中的表达量均表现为9胚龄或者12胚龄最高,与其他各阶段差异显著,随后下降,并在出雏后维持在较低水平;肝脏中IRS1的表达模式与IGF1R一致。IGF1、IGF1R和IRS1基因的表达两两之间均表现出显著或极显著的正相关关系,同时,肌肉中3个基因的表达与体重、胸(腿)肌重存在显著的负相关,而肝脏中3个基因的表达与体重、胸(腿)肌重、肝脏重均存在显著的正相关。【结论】IGF1-PI3K-AKT信号通路相关基因之间存在一致性趋势,品种间和组织间表达量的差异可能正是不同类型黄羽肉鸡生长发育差异的主要原因之一。

PI_3K-Akt信号通路阻抑对结肠癌细胞LS-174T顺铂耐药逆转机制的研究

目的:观察抑制磷脂酰肌醇3激酶和(或)蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路对顺铂耐药结肠癌细胞株LS-174T细胞核中Y-Box结合蛋白1(Y-Box binding protein-1,YB-1)的活性的影响及肿瘤细胞顺铂耐药性的改变.方法:采用顺铂(cisplatin,DDP)药物浓度递增法、间歇性作用的体外诱导法建立人结肠癌的顺铂耐药细胞系LS-174T/DDP,药物Ly294002阻断PI3K-Akt信号通路传导后,采用Western Blot方法检测耐药肿瘤细胞磷酸化Akt表达水平,电泳迁移改变分析(EMSA)方法检测其核中转录因子YB-1活性的改变,MTT法检测DDP对细胞增殖的抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:阻断PI3K-Akt信号通路后,顺铂耐药细胞株中磷酸化Akt蛋白表达水平显著下降,同时其细胞核中YB-1的活性明显降低,且细胞的生长抑制率及细胞凋亡率均明显升高(P<0.01).结论:阻断PI3K-Akt信号通路能够提高顺铂耐药细胞株对顺铂的敏感性,PI3K-Akt信号通路可能通过激活YB-1在肿瘤顺铂耐药机制中发挥重要作用.

芪珀生脉颗粒通过调节PI3K/SGK1信号通路改善心房颤动大鼠心房肌纤维化

目的验证芪珀生脉颗粒通过调节PI3K/SGK1信号通路改善心房颤动(简称“房颤”)大鼠心房肌纤维化的机制。方法采用尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙(Ach-CaCl2)建立房颤大鼠模型,随机分为正常对照组、模型组、维拉帕米组、芪珀生脉大剂量组、芪珀生脉中剂量组、芪珀生脉小剂量组,共6组。用药干预4周后,比较各组大鼠房颤持续时间、心房肌组织病理改变,运用Western Blot法检测PI3K/SGK1信号通路蛋白的表达水平。结果与模型组相比,芪珀生脉颗粒各剂量组大鼠房颤持续时间显著缩短,大鼠心房肌PI3K、CTGF蛋白表达明显下调,SGK1蛋白的磷酸化明显减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。结论芪珀生脉颗粒可有效改善房颤过程中的心房纤维化、缩短房颤持续时间,其机制可能与其调节PI3K/SGK1信号通路,包括下调PI3K、CTGF蛋白的表达,减少SGK1蛋白的磷酸化有关。

葛根素介导PTEN-PI3K-AKT信号通路抑制绝经后骨质疏松症的机制研究

目的观察葛根素对去卵巢骨质疏松症小鼠骨组织形态的影响以及PTEN-PI3K-AKT信号通路的变化情况,并探讨其分子机制。方法选取10~12周龄,体重约20~25 g的C57BL/6雌性小鼠24只,随机分为假手术组(Sham)、去卵巢组(Ovx)、葛根素组(Pue)。术后8周,鉴定为骨质疏松模型后开始给药干预,连续给药12周,每组随机取6只小鼠采取颈椎脱臼法处死。取左侧股骨进行Micro-CT扫描并通过real-time PCR法检测骨组织内PTEN、Foxo1、catalase基因的相对表达量。取右侧股骨制成石蜡切片观察其形态结构并采用免疫组化方法观察骨组织中PTEN、P-AKT、catalase蛋白的表达情况。结果术后8周Ovx组,小鼠子宫萎缩变小、骨组织HE染色骨小梁明显稀疏、Micro-CT骨小梁断裂明显。给药后,Pue组骨小梁增多、骨髓腔缩小,骨连接增多;PCR结果表明,葛根素干预后PTEN、Foxo1、catalase基因表达上调(P<0.05,差异有统计学意义);免疫组化结果表明,PTEN、catalase蛋白表达上调,P-AKT蛋白下调,但变化差异不明显。结论葛根素可能通过介导PTEN-PI3K-AKT信号通路抑制绝经后骨质疏松症。

PI3K/SGK1信号通路上调小鼠肺上皮钠通道表达的研究

目的:探讨磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/血清-糖皮质激素调节激酶1(SGK1)信号通路对小鼠肺上皮钠通道(ENaC)表达的影响。方法:24只健康成年C3H/HeN小鼠随机分为对照组、急性肺损伤(ALI)组、胰岛素组和PI3K siRNA组,每组6只。收集支气管肺泡灌洗液(BALF),测量肺泡液体清除率(AFC),免疫荧光测定ENaC各亚基。培养原代小鼠肺泡上皮II型细胞,分别转染PI3K siRNA和SGK1 siRNA,RT-PCR法测定ENaC的mRNA表达,Western blot法测定ENaC蛋白表达和SGK1磷酸化水平。结果:与ALI组比较,胰岛素组AFC和ENaC各亚基表达均显著增加(P<0.05)。与胰岛素组比较,PI3K siRNA组AFC和ENaC各亚基表达均显著减少(P<0.05)。与胰岛素干预比较,肺泡上皮细胞分别转染PI3K siRNA和SGK1 siRNA后,ENaC各亚基的mRNA和蛋白表达显著减少(P<0.05),SGK1磷酸化水平显著降低(P<0.05)。结论:激活PI3K/SGK1信号通路通过上调小鼠肺ENaC各亚基的表达,增强AFC,从而减轻小鼠ALI。

磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶信号通路介导的血红素氧合酶-1表达在七氟醚后处理心肌保护中的作用

目的研究七氟醚后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用是否与血红素氧合酶-1(HO-1)表达上调有关,且这种表达上调机制与激活磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶(PI3K-Akt)信号通路的关系。方法取健康雄性SD大鼠30只,体质量230~290 g,按随机数字表法分为5组(每组6只):假手术组(S组)、心肌缺血再灌注损伤组(I/R组)、七氟醚后处理组(Se组)、七氟醚后处理+PI3K抑制剂渥漫青霉素(Wortman-nin)组(Se+W组)、Wortmannin组(W组)。S组:丝线穿过冠状动脉左前降支(LAD)但不结扎;其余4组均进行结扎和再灌注过程,I/R组:结扎LAD 30 min再灌注120 min;Se组:在恢复血供前1 min吸入1.0 MAC的七氟醚5 min;Se+W组:操作同七氟醚后处理组,但在给予七氟醚前,经股静脉注入PI3K抑制剂Wortmannin(15μg/kg);W组:在恢复血供前5 min经股静脉注射Wortmannin(15μg/kg)。再灌注120 min时,(1)采腹主动脉血测肌钙蛋白(c Tn-I)含量。(2)取大鼠心尖组织测定丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。(3)蛋白质印迹法测待测心尖组织中Akt、p-Akt及HO-1蛋白的表达,并计算p-Akt Akt比值。结果与S组比较,其余4组c Tn-I、p-Akt Akt、HO-1及MDA含量明显升高,SOD活力降低,差异有统计学意义(P<0.05);与I/R组相比,Se组c Tn-I、MDA含量下降明显,p-Akt Akt比值、HO-1蛋白表达、SOD活力升高,差异有统计学意义(P<0.05);与Se组比较,Se+W组及W组血清c Tn I含量、心肌组织MDA含量显著升高,心肌组织HO-1、p-Akt表达下调,p-Akt Akt降低,心肌组织SOD活力降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论七氟醚后处理通过影响HO-1表达对大鼠的心肌缺血再灌注损伤产生保护作用,其机制可能与PI3K-Akt通路介导有关。

脓毒症心肌抑制大鼠PTEN-PI3K-Akt信号通路的激活对心肌组织损伤及凋亡的影响

目的探讨脓毒症心肌抑制大鼠心肌组织PTEN-PI3K-Akt信号通路的激活对大鼠心肌组织损伤及细胞凋亡的影响.方法采用盲肠结扎穿孔术构建脓毒症心肌抑制大鼠模型,并分成对照组、模型组及BPV干预组,每组10只.采用RT-PCR及Western blot检测心肌组织PTEN-PI3K-Akt信号通路关键因子磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、Akt-1、Cyclin D1 mRNA及蛋白的表达,采用TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡情况,采用HE染色观察不同组大鼠心肌组织结构.结果BPV干预组PTEN基因的mRNA及蛋白表达量较模型组下降(P<0.05),同时PI3K-Akt信号通路PI3K、Akt、Akt-1、Cyclin D1的mRNA及蛋白表达量上升(P<0.05);BPV干预组心肌组织细胞的凋亡率低于模型组(P<0.05).正常组大鼠心肌细胞结构整齐,无病理迹象;模型组大鼠心肌细胞呈现脓毒症心肌抑制的典型损伤特征;BPV干预组心肌损伤有所改善.结论激活PTEN-PI3K-Akt信号通路有助于减少细胞凋亡,改善心肌损伤.

类胰岛素生长因子1对自然衰老小鼠的抗肥胖作用

背景:实验室前期研究发现青年脂肪干细胞移植到老年小鼠体内会有减重效果,并且能改善老年小鼠体内炎症状态,推测类胰岛素生长因子1可能对于衰老和肥胖具有重要作用。目的:探究类胰岛素生长因子1对自然衰老小鼠的抗肥胖作用。方法:①生物信息学分析:对GEO数据库中肥胖患者的脂肪组织测序,并对青年小鼠脂肪干细胞和老年小鼠脂肪干细胞进行转录组学测序,分析类胰岛素生长因子1表达情况。②动物实验验证:2月龄雄性C57BL/6J小鼠(青年小鼠)6只,20月龄雄性C57BL/6J小鼠(老年小鼠)12只。采用ELISA和qRT-PCR检测青年小鼠和老年小鼠的腹部脂肪组织和血清类胰岛素生长因子1的表达情况。将老年小鼠12只随机分为2组:实验组连续4周注射类胰岛素生长因子1蛋白(50μg/kg),对照组注射同等剂量的PBS。定期监测实验组和对照组小鼠体质量变化,实验结束时测量小鼠葡萄糖耐受,ELISA检测小鼠血清炎症因子、腹部脂肪组织炎症因子,苏木精-伊红染色观察肝、肾及腹部脂肪组织病理变化,qRT-PCR检测腹部脂肪组织炎症因子、PI3K-AKT信号通路mRNA的表达水平。结果与结论:①肥胖患者脂肪组织低表达类胰岛素生长因子1,并在接受减肥手术后类胰岛素生长因子1表达上升;②老年脂肪干细胞低表达类胰岛素生长因子1;③老年小鼠腹部脂肪组织和血清均低表达类胰岛素生长因子1;④注射类胰岛素生长因子1蛋白能显著降低老年小鼠的体质量并改善胰岛素抵抗;⑤老年小鼠肝脏病理切片发现有脂肪堆积情况,注射类胰岛素生长因子1蛋白后,脂肪堆积情况显著改善,并且显著降低了脂肪组织的脂滴大小;⑥注射类胰岛素生长因子1能显著降低老年小鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的表达水平,显著增加脂肪组织PI3K-AKT信号通路的表达;⑦结论:外源性类胰岛素生长因子1能降低老年小鼠体质量、减小脂肪组织脂滴大小及改善肝脏脂肪堆积情况,改善老年小鼠的炎症状态,可能是通过激活PI3K-AKT信号通路改善老年小鼠的炎症状态,从而改善自然衰老小鼠的肥胖。

IGF-1对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞凋亡的保护作用及其机制

目的探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对β-淀粉样蛋白25-35(amyloid-beta protein,Aβ_(25-35))诱导PC12细胞凋亡的保护作用及可能的信号机制。方法以10μmol/L Aβ_(25-35)处理PC12细胞作为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)细胞模型。实验分为对照组、Aβ_(25-35)处理组、IGF-1+Aβ_(25-35)处理组。条件孵育24 h,采用噻唑蓝比色法(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)检测细胞存活率,Western blot检测各组细胞磷酸化-Akt(phospho-Akt,p-Akt)蛋白表达水平。结果 MTT法检测显示,10μmol/L Aβ_(25-35)孵育24 h,PC12细胞存活率为(39.8±3.7)%,与对照组[(100.0±2.3)%]相比显著下降(P<0.05)。IGF-1+Aβ_(25-35)处理组,PC12细胞存活率为(56.4±4.2)%,与Aβ_(25-35)处理组[(39.8±3.7)%]相比显著增高(P<0.05)。Western blot显示,IGF-1+Aβ_(25-35)处理组p-Akt蛋白表达水平(0.794±0.037)高于Aβ_(25-35)处理组(0.493±0.050),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 IGF-1能抑制Aβ_(25-35)所导致的PC12细胞凋亡,其保护作用可能与上调Akt磷酸化的表达有关。

从PTEN-PI3K-AKT信号通路探讨补肾疏肝方含药血清抑制人肺腺癌A549细胞增殖和转移的机制

目的:通过研究补肾疏肝方含药血清对PTEN-PI3K-AKT信号通路的影响,探讨补肾疏肝方抑制肺腺癌细胞增殖和转移作用机制。方法:大鼠60只,随机分为6组,每组10只,分别为生理盐水组(NS为2 m L),顺铂组(8 mg·kg-1),补肾疏肝方低剂量组(15 g·kg-1),补肾疏肝方高剂量组(30 g·kg-1),联合顺铂低剂量组(15 g·kg-1+8 mg·kg-1),联合顺铂高剂量组(30 g·kg-1+8 mg·kg-1),每只大鼠ig,2 m L,每天2次,共5 d。制备药物血清:经药物作用后的大鼠,经腹主动取血,分离血清,灭活,过滤,冻存。MTT法检测补肾疏肝方含药血清对A549细胞增殖的影响。三维细胞培养观察并计数各组细胞形成管状结构数量。RT-PCR检测含药血清对A549肺腺癌细胞AKT-1,Cyclin D1,NF-κB mRNA水平的表达,Western blot检测含药血清对PTEN,p-PI3K,p-AKT蛋白水平的表达。结果:低剂量补肾疏肝方含药血清对A549细胞有抑制作用,低剂量中药与顺铂联用有协同作用且以时间依赖方式,即补肾疏肝方低剂量组与联合顺铂低剂量组在48,72,96 h的抑制率均高于其他组(P<0.05,P<0.01);补肾疏肝方低剂量组与联合顺铂低剂量组拟态血管数目均低于其他组(P<0.05,P<0.01);补肾疏肝方低剂量组与联合顺铂低剂量组PTEN蛋白表达均高于其他组(P<0.05,P<0.01),补肾疏肝方低剂量组与联合顺铂低剂量组p-PI3K,p-AKT蛋白,Akt1,Cyclin D1,NF-κB的mRNA表达均低于其他组(P<0.05,P<0.01)。结论:补肾疏肝方含药血清可通过PTEN-PI3K-AKT信号通路抑制人肺腺癌A549细胞增殖和转移。

头针对MPTP诱导的PD小鼠行为学及PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白表达的影响

目的:观察头针对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的PD小鼠行为学及PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白表达的影响。方法:50只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组(control group)、模型组(model group)、针刺组(BMA group)和美多巴组(Madopar group),每组各10只。通过腹腔注射MPTP建立PD模型,建模成功后分别进行相应的干预共14 d,分别于实验前1 d,造模成功后第0 d,干预第7 d和干预第14 d进行爬杆和悬挂行为学观察;干预的第14 d处死各组大鼠,中脑和纹状体取材,行Western Blot法检测PI3K-AKT信号通路相关因子PI3K及p-Akt(Ser473)的蛋白表达的情况。结果:1.爬杆实验结果显示,与实验前及空白组比较,模型组、针刺组及美多芭组小鼠爬杆实验评分均下降(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,针刺组及美多芭组小鼠在接受干预后爬杆实验得分均呈增长趋势(P<0.05)。2.悬挂实验结果表明,与实验前及空白组比较,模型组、针刺组及美多芭组小鼠悬挂实验评分均下降(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,针刺组及美多芭组小鼠在接受干预后悬挂实验得分均呈增长趋势(P<0.05)。行为学实验中,针刺组与美多芭组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.Western Blot结果显示,PD建模成功后PI3K蛋白表达快速上升,经针刺及美多芭干预后PI3K蛋白表达均有不同程度的下降;PD建模成功后p-Akt(Ser473)蛋白表达快速下降,经针刺及美多芭干预后p-Akt(Ser473)蛋白表达均有不同程度的上升。结论:头针针刺可能是通过激活PI3K-AKT信号通路、调节PI3K及p-Akt(Ser473)蛋白水平来抗细胞凋亡,可在一定程度上改善PD小鼠的运动迟缓的症状、提升其运动平衡的能力,且效果与西药美多芭大致相当。

沉默lncRNA TPT1-AS1对非小细胞肺癌生物学行为的影响及机制研究

目的研究长链非编码RNA(lncRNA)TPT1-AS1在非小细胞肺癌组织中的表达及对沉默lncRNA TPT1-AS1非小细胞肺癌生物学行为的影响及机制。方法检测非小细胞肺癌组织和癌旁组织lncRNA TPT1-AS1表达情况,做细胞培养及lncRNA TPT1-AS1转染,分为空白组、过表达组、沉默组,过表达组转染si-TPT1-AS1-NC质粒,沉默组转染si-TPT1-AS1质粒,空白组细胞不做任何处理,转染24h后鉴定转染效率。检测各组细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及PTEN-PI3K-AKT信号通路蛋白表达情况。结果与癌旁组织相比,癌组织TPT1-AS1 mRNA表达量升高(P<0.05)。与空白组相比,过表达组TPT1-AS1 mRNA表达量升高,沉默组TPT1-AS1 mRNA表达量降低(P<0.05),说明转染成功。与过表达组相比,沉默组各时间点细胞增殖率、细胞迁移数、侵袭数、p-PI3K、p-AKT、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达量降低,凋亡率、PTEN、Bax蛋白表达量升高(P<0.05)。结论lncRNA TPT1-AS1在非小细胞肺癌组织高表达,沉默lncRNA TPT1-AS1可抑制肺癌细胞增殖、迁移、侵袭,促进凋亡,其机制可能与调控PTEN-PI3K-AKT信号通路相关。

FGF21作为运动因子在有氧运动抑制心梗心肌细胞凋亡中的作用及其机制探讨

目的:探讨成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)在有氧运动抑制心肌梗死(myocardialinfarction,MI)大鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制。方法:雄性Sprague-Dawley大鼠40只,体重180～220g,心梗模型采用左冠状动脉前降支永久性结扎的方法,术后随机分为假手术组(S组)、心梗安静组(MI组)和心梗+有氧运动组(ME组),S组只穿线不结扎。ME组在术后1周进行4周跑台训练。训练后次日腹腔麻醉,测定LVSP、LVEDP和±dp/dtmax评价心功能。培养H9C2大鼠心肌细胞并采用浓度为400μmol/L的H2O2刺激4h构建心肌细胞凋亡模型,采用AMPK激动剂AICAR和FGF21受体FGFR1抑制剂PD166866干预H9C2大鼠心肌细胞。Masson染色观察分析心肌胶原容积分数(collagenvolumefraction,CVF%)。Western blotting检测心肌FGF21、FGFR1、Bax、Bcl-2的蛋白表达及PI3K-Akt通路蛋白的表达,RTqPCR测定心肌FGF21和FGFR1的表达,TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况。结果:与S组比较,MI组心肌FGF21、FGFR1、Bax/Bcl-2以及PI3K、Akt蛋白表达显著升高,FGF21和FGFR1表达显著升高,TUNEL阳性颗粒显著增加,胶原纤维百分比升高,心功能下降;与MI组比较,ME组心肌FGF21、FGFR1以及PI3K、Akt蛋白表达进一步升高,Bax/Bcl-2显著下降,TUNEL阳性颗粒显著减少,胶原纤维百分比下降,心功能改善;且心肌FGF21表达与抑制心肌细胞凋亡和心功能改善呈显著正相关。PD166866干预H9C2大鼠心肌细胞Bax/Bcl-2表达显著升高,TUNEL阳性颗粒显著增加,炎性因子TNF-α/IL-10显著升高,PI3K-Akt蛋白表达显著下降;AMPK激动剂AICAR单一干预或与FGF21受体抑制剂PD166866二者联合干预均可显著逆转此不利影响。结论:有氧运动可显著上调心梗大鼠心肌FGF21/FGFR1的表达,其机制是通过激活下游PI3K-Akt信号通路,降低心梗心脏炎症反应,进而抑制心肌细胞凋亡。表明,FGF21/FGFR1/PI3K-Akt信号通路在有氧运动抑制心肌细胞凋亡、降低心肌胶原纤维化面积扩增和改善心功能方面发挥重要作用。

接头蛋白Gab1的结构及功能研究进展

Gab1蛋白属于接头蛋白Gab家族,该家族蛋白因能与生长因子受体结合蛋白2(Grb2)相结合而得名。作为接头蛋白,Gab1蛋白能被多种受体酪氨酸激酶或非受体酪氨酸激酶激活,接受胞外多种生长因子、细胞因子和一些T/B细胞抗原受体的刺激,介导PI3K/Akt和Ras/MAPK等多条信号转导途径,具有促进细胞生长、迁移、调节免疫等多种生物学功能,与糖尿病、肿瘤、心血管疾病等的发生发展密切相关。

miR-1与糖尿病心肌肥大的相关性

目的探讨糖尿病心肌病心肌肥大与miR-1表达量之间的关系。方法给C57BL/6小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ),建立糖尿病心肌病心肌肥大模型,8周后取心脏组织并称其重量,提取RNA并逆转录,用qRT PCR检测miR-1的表达,检测糖尿病模型小鼠心脏组织中的相关靶基因BNP和ANP并确定糖尿病心肌病心肌肥大模型建立成功。培养大鼠心肌细胞H9C2细胞,对细胞进行高糖和低糖处理,24h后收集细胞,提取RNA并逆转录,用qRT PCR检测miR-1的表达。收集正常人血清,1型和2型糖尿病病人血清以及1型糖尿病心肌肥大病人血清,检测血清中miR-1的表达。Western blot检测高糖和低糖处理24h的H9C2细胞中p-Akt和AKT的表达。向H9C2细胞中加入Akt抑制剂LY294002,qRT PCR检测miR-1的表达量。结果 qRT PCR检测发现糖尿病心肌肥大小鼠心脏组织中的miR-1的表达降低,高糖处理的H9C2细胞中miR-1的表达降低,1型糖尿病心肌肥大病人血清中的miR-1的表达降低。Western blot检测发现高糖处理的H9C2细胞中pAkt和AKT的表达升高,当加入Akt抑制剂LY294002时,qRT PCR检测发现miR-1的表达量升高。结论糖尿病心肌肥大时,miR-1起到了关键作用,并且糖尿病心肌肥大的心脏组织中PI3K-Akt信号通路明显抑制了miR-1的表达。

沉默神经元HIF-1α和PTEN的表达对体外培养的大鼠神经元氧糖剥夺损伤的影响

目的利用RNA干扰技术分别沉默神经元中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和磷酸酶并和张力蛋白同源物(PTEN)基因,论证它们在神经元体外氧糖剥夺(OGD)损伤后的功能调控作用。方法构建并筛选靶向HIF-1α及PTEN基因的shRNA慢病毒载体;提取并将原代神经元分为4组:(1)NC组,仅加空载病毒;(2)NC+OGD组,加空载病毒后缺氧;(3)Si-hif-1α+OGD组,加Si-hif-1α病毒后缺氧;(4)Si-pten+OGD组,加Si-pten病毒后缺氧,均在培养第3天感染病毒,第7天OGD损伤模拟细胞缺氧。缺氧后24 h行荧光实时定量PCR(qRT-PCR)法检测干扰效率,行乳酸脱氢酶(LDH)检测及AnnexinV-FITC/PI检测神经元细胞损伤、凋亡变化,Western blot检测相应蛋白表达变化。结果慢病毒介导的shRNA能有效沉默目的基因mRNA的表达;HIF-1α沉默后,缺氧细胞的损伤及凋亡加重,PTEN蛋白的表达升高,p-PTEN、p-AKT、NR2A及VEGFa表达降低(P<0.05);PTEN沉默后,缺氧细胞的损伤及凋亡有所减轻,p-PTEN、p-AKT表达升高(P<0.05),HIF-1α、NR2A及VEGFa的表达无显著变化(P>0.05)。结论慢病毒介导的shRNA能有效沉默神经元HIF-1α及PTEN的表达,逆转神经元缺氧损伤中HIF-1α升高对PTEN活性的抑制,参与神经元损伤调控。

基于网络药理学探讨人参皂苷R b1肠道菌转化物治疗胃癌的作用机制

目的:基于网络药理学技术研究人参皂苷R_(b1)的肠道菌转化物-人参皂苷R_(d)及人参皂苷F_(2)治疗胃癌的作用机制,为人参皂苷的临床合理应用提供科学依据。方法:Swiss Target Prediction数据库预测人参皂苷R_(d)及人参皂苷F_(2)的靶点;以“Gastric cancer”为关键词在Disgenet、Malacards和Omim数据库中获得胃癌的靶点;将人参皂苷R_(d)及人参皂苷F_(2)的PPI网络分别与胃癌的PPI网络取交集分别获得人参皂苷R_(d)及人参皂苷F_(2)治疗胃癌的PPI网络;分别将人参皂苷R_(d)及人参皂苷F_(2)治疗胃癌的核心靶点导入到Metascape数据库中,得到GO分析结果和KEGG富集结果。结果:网络药理学结果表明人参皂苷R_(d)及人参皂苷F_(2)治疗胃癌的关键靶点分别有64个及56个。结合人参皂苷R_(d)及人参皂苷F_(2)的生物学特性,发现PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、HIF-1t信号通路及ErbB信号通路可能是上述两种人参皂苷抗胃癌作用涉及的主要通路。结论:人参皂苷R_(b1)肠道菌群转化物-人参皂苷R_(d)及人参皂苷F_(2)可能通过调节PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、HIF-1t信号通路及ErbB信号通路治疗胃癌,后续可开展相关实验加以验证。

复方黄柏液涂剂促进Ⅲ度烧伤创面肉芽组织形成的作用机制研究

目的:基于网络药理学和分子对接方法,确定复方黄柏液治疗的Ⅲ度烧伤肉芽组织愈合的有效活性成分、关键靶点和潜在的药理学机制,并进行肉芽组织成纤维细胞的初步验证。方法:从公共数据库中药系统药理学分析平台(TCMSP)检索复方黄柏液组成成分连翘、黄柏、金银花的有效成分和靶点;GeneCards、OMIM数据库检索“Ⅲ度烧伤”疾病相关靶点。通过生物信息学分析,包括蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-proteininteraction,PPI)以及基因本体(Gene ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析,获得了关键的有效成分、核心靶点和相关信号通路;DiscoveryStudio分子对接分析有效成分化合物与靶蛋白的结合。0.5%的DMSO溶液处理的成纤维细胞记为对照组;槲皮素(40μmol/ml)处理的成纤维细胞记为槲皮素组。采用CCK8法、Transwell实验检测细胞增殖、迁移侵袭;WB试验检测细胞p-PI3K、p-Akt蛋白。结果:共筛选出74个有效成分,331个作用靶点,AKT1为潜在的治疗靶点,木犀草素、山柰酚、槲皮素、汉黄芩素、丹皮酚为潜在的候选药物。PI3K-AKT信号通路可能在复方黄柏液治疗Ⅲ度烧伤中发挥关键作用;分子对接表明槲皮素与AKT1结合最好。与对照组相比,槲皮素组成纤维细胞增殖、迁移侵袭均显著降低,p-PI3K、p-Akt蛋白表达也显著降低(P<0.05)。结论:复方黄柏液促进Ⅲ度烧伤患者肉芽组织形成的生物活性成分为槲皮素,潜在通路为PI3K-AKT信号通路,为复方黄柏液治疗Ⅲ度烧伤的研究提供了思路。

基于网络药理学与实验验证研究荜茇抗肺纤维化的作用机制

目的:通过网络药理学及分子对接技术初步预测荜茇抗肺纤维化的活性成分、作用靶点及信号通路,并通过体外实验进行初步验证荜茇抗肺纤维化的作用机制。方法:从TCMSP、Swiss Target Prediction和Pub Chem等数据库中获取药物的有效成分及对应靶点。使用Gene Cards和OMIM数据库收集疾病的相关靶点。利用jvenn在线工具筛选出药物与疾病的交集靶点,通过String数据库及Cytoscape3.9.1软件构建“药物-成分-靶点”与PPI网络图。使用微生信平台对交集靶点进行GO及KEGG富集分析,将富集KEGG前20条通路、核心靶点、药物成分,构建“成分-靶点-通路”网络并进行可视化。利用分子对接技术将药物成分与靶点进行对接,并对其部分对接结果可视化。培养HFL-1细胞,采用MTT法检测各浓度对细胞活力的影响,计算抑制率,从而筛选出最佳的药物浓度。将体外培养的HFL-1细胞分为4组,即对照组、TGF-β1组、TGF-β1+LD组(联合LD组)、TGF-β1+HD组(联合HD组)。采用CCK-8试剂检测24、48、72 h的细胞增殖活性。采用平板克隆形成实验来观察药物对HFL-1细胞克隆形成能力的影响。采用RT-qPCR和Western blot实验观察各组细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COI-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(COI-Ⅲ)的m RNA和PI3K-Akt信号通路蛋白表达水平。结果:共获得荜茇与抗肺纤维化交集靶点为197个。经拓扑学分析获得核心PPI网络,包含29个节点与199条边;GO功能分析显示,荜茇治疗肺纤维化(PF)生物学过程包括:凋亡过程负调控、信号转导、蛋白质磷酸化等。细胞成分包括:细胞质、核浆、等离子体膜。分子功能包括相同的蛋白结合、丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白结合等。KEGG信号通路被155条富集,而其中已被证实,与PF密切相关为PI3K-Akt信号通路,富集排名第四“。成分-靶点-通路”网络中PIK3CA、MAPK3、MAPK1、MTOR、SRC、CCND1、EGFR、PRKCA、BCL2、GSK3B链接度最高。荜茇宁、N-(2,5-二甲氧基苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺、四氢丹参酮、豌豆素和胡椒碱是关键化合物。分子对接结果显示,除N-(2,5-二甲氧基苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺外,其余化合物与10个链接度高的蛋白质结合活性较好。体外实验显示,48、72 h联合LD组增殖能力明显低于TGF-β1组(P<0.05),24、48、72 h联合HD组又显著低于联合LD组。各药物组克隆数量显著减少(P<0.05)。联合LD和联合HD组α-SMA、COl-I、COl-Ⅲm RNA和蛋白表达水平明显低于TGF-β1组。与TGF-β1组相比,两个剂量组中p-PI3K/PI3K、pAKT/AKT蛋白表达显著减少(P<0.01)。结论:荜茇抗PF作用,其机制可能通过调控PI3K-Akt信号通路而发挥治疗PF作用。