PTEN-Long在胃癌细胞中的表达及其过表达对PI3K/AKT信号通路及细胞生长和凋亡的影响

目的探讨PTEN-Long在胃癌细胞中的表达及其对胃癌细胞(SGC-7901)增殖、凋亡的影响。方法RT-qPCR与Western免疫印迹检测胃癌细胞中PTEN-Long mRNA及蛋白表达水平,选择最佳干预细胞系,将携带PTEN-Long基因的重组慢病毒载体转染SGC-7901细胞(PTEN-Long组),转染空载慢病毒作为NC组,未转染细胞作为Control组,检测转染效率;MTT法与Edu染色检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡;Western免疫印迹检测P27、cyclin D1及PI3K/AKT通路相关蛋白表达。结果PTEN-Long mRNA及蛋白在胃癌细胞表达水平显著降低(P<0.05),在SGC-7901细胞中表达水平最低,选择SGC-7901细胞进行后续实验;RT-qPCR与Western免疫印迹证实慢病毒转染成功;与Control组和NC组相比,PTEN-Long组细胞增殖活性显著降低,G_(0)/G_(1)期的细胞比例显著升高,G_(2)/M、S期细胞比例显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高,P27蛋白表达水平显著升高,p-PI3K、p-AKT、Cyclin D1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论PTEN-Long在胃癌中下调表达,过表达PTEN-Long可通过抑制PI3K/AKT信号通路激活抑制胃癌细胞增殖,促进细胞凋亡。

PTEN-Long对肝癌细胞的抑制作用研究

目的探讨第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)基因编码PTEN的一种变形体PTEN-Long对肝癌细胞的抑制作用。方法细胞质粒转染法转染PTEN-Long于人肾上皮293T细胞,其溶解产物通过疏水作用和离子交换作用分离纯化PTEN-Long蛋白;采用Western blot法检测分离纯化的PTEN-Long蛋白;以不同浓度PTEN-Long蛋白干预肝癌HepG2、HUH6、FOCUS细胞,并采用MTS法检测细胞存活情况。将40只129S1/SvImJ小鼠按随机数字表法分为PTEN-Long组(腹腔注射0.2ml PTEN-Long,剂量4mg/kg体重,1次/d)和对照组(腹腔注射0.2ml 0.9%氯化钠注射液,1次/d),每组20只。小鼠大腿根部接种肝癌HepG2(两组分别各10只)或HUH6(两组分别各10只)细胞混合液,游标卡尺测量计算肿瘤体积。结果分离纯化后PTEN-Long蛋白纯度较高,约80%。与空白对照组比较,5nmol/L浓度以上的PTEN-Long对肝癌HepG2、HUH6细胞有明显的抑制作用,差异均有统计学意义(均P<0.05),而PTEN-Long对肝癌FOCUS细胞无明显抑制作用,差异均无统计学意义(均P>0.05)。异种移植试验显示,与对照组相比,PTEN-Long组小鼠肿瘤体积明显较小(P<0.05)。结论分离纯化提取的PTEN-Long对肝癌细胞起抑制作用,这或为肝癌分子靶向治疗提供新思路。

PTEN-Long对人脑胶质瘤U251细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

目的探索PTEN-Long对U251细胞增殖、侵袭及凋亡的影响及相关机制。方法将携带PTEN-Long基因的重组慢病毒载体转染U251细胞。未感染慢病毒的细胞为对照组(U251),感染LV-EGFP的细胞为空载组(U251-EGFP),感染LV-PTEN-Long-EGFP的细胞为过表达组(U251-PTEN-Long-EGFP)。通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,并应用RT-PCR、Western blot法检测LV-PTEN-Long-EGFP转染效率。通过RT-PCR、Western blot法检测各组细胞PI3K-AKT-NF-κB信号通路表达情况;CCK8法检测各组细胞增殖能力;流式细胞分析术检测各组细胞周期变化;划痕实验检测各组细胞迁移能力;Transwell小室法检测各组细胞侵袭能力。结果 LV-PTEN-Long-EGFP转染U251细胞后,经荧光显微镜、RT-PCR和Western blot证实转染成功(P <0.01)。与对照组及空载组比较,RT-PCR显示过表达组NF-κB p65、bcl-xl表达水平降低,IκBα表达水平增加(P <0.01);Western blot显示过表达组p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65、bcl-xl表达水平降低,IκBα表达水平增加,差异有统计学意义(P <0.01)。PTEN-Long下调PI3K-AKT-NF-κB信号通路。过表达组增殖、迁移、侵袭能力受抑制(P <0.01),细胞周期被阻滞在G0/G1期(P <0.01)。结论 PTENLong可能通过抑制PI3K-AKT-NF-κB信号通路,抑制U251细胞增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡。

慢病毒介导PTEN-Long过表达抑制人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的生长

背景:第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosohataseandtensinhomolguedeletedon chromosome10,PTEN)的翻译变体(PTEN-Long)是新发现的一种肿瘤抑制基因,与多种肿瘤的发展密切相关。目的:探讨PTEN-Long对人脑胶质瘤U251细胞裸鼠异体移植瘤生长的抑制作用及相关分子机制。方法:(1)人脑胶质瘤细胞U251购自国家实验细胞资源共享服务平台北京总部,实验将未感染慢病毒的U251为对照组,感染LV-EGFP的U251为空载组,感染LV-PTEN-Long-EGFP的U251为过表达组,用荧光显微镜、Western blot检测转染效率;(2)实验将购自北京华阜康生物科技股份有限公司的BALB/c-nu雄性裸鼠随机分为3组,将3组细胞分别接种于裸鼠背部皮下,观察裸鼠一般状况及肿瘤生长趋势,分析各组裸鼠皮下肿瘤的体积及质量变化,免疫组织化学染色法检测肿瘤中PTEN-Long,p-Akt及NF-κB p65蛋白表达变化情况。结果与结论:(1)一般状况:PTEN-Long过表达后可抑制裸鼠皮下胶质瘤细胞的增殖,与对照组及空载组相比,过表达组裸鼠肿瘤体积及质量减少(P <0.01);(2)免疫组织化学染色显示:与对照组及空载组相比,过表达组PTEN-Long表达量增加(P<0.05),p-Akt及NF-κBp65表达量降低(P<0.05);(3)结果显示:PTEN-Long可抑制人脑胶质瘤U251细胞裸鼠异体移植瘤的生长,机制可能与下调PI3K-AKT-NF-κB信号通路有关。

PTEN-Long在肿瘤治疗中的研究进展

PTEN-L是第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的翻译变体,是近年来新发现的一种具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,与多种肿瘤的发生、发展密切相关。PTEN和PTEN-L可通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB,又称AKT)信号转导通路调控细胞周期,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移,并诱导肿瘤细胞凋亡,维持细胞的正常心理活动。PTEN-L前导序列中表达的173个氨基酸赋予其特殊的细胞外分泌和穿透细胞膜的作用。PTEN-L作为抑癌基因,以蛋白质的形式在多种肿瘤的基因治疗中发挥着重要的作用,并且可与其他多种肿瘤抑制因子联合应用从而发挥累积作用,为肿瘤的基因治疗提供了潜在的靶点,具有很好的发展前景。PTEN和PTEN-L既有共性,又有各自的特异性。本文就PTEN和PTEN-L的基本结构和功能、PTEN-L相关信号通路在分子机制中的作用,以及PTEN-L前导序列在肿瘤治疗中的应用作一简要综述。

PTEN和PTEN-Long的关系及其抑瘤作用

第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)是继P53之后发现的又一抑癌基因,其编码的蛋白产物包括了张力蛋白样结构域和双重特异性的磷酸酶结构域。令人吃惊的是,2013年研究人员发现该抑癌基因的mRNA在翻译过程中因选择不同的翻译起始密码子,会产生一种具有类似于病毒穿膜机制的蛋白产物,该蛋白产物稍长于PTEN,也具有抑癌作用,故命名为PTEN-Long。由于PTEN-Long既具有分泌和穿过细胞膜的能力,又能像传统抑癌蛋白那样对肿瘤起杀伤作用,这使得PTEN-Long在肿瘤治疗中具有很好的前景。PTEN和PTEN-Long既有共性,又有各自的特异性,本文就PTEN和PTEN-Long基因及其编码的蛋白在结构和功能的异同及其抑瘤作用作一综述,为进一步研究PTEN和PTEN-Long提供理论基础。

P-Rex2a干扰PTEN-long对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨P-Rex2a干扰PTEN-long对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 回顾性选取2018年1月至12月在上海市第八人民医院行胃癌根治术患者的胃癌组织和癌旁组织(距离癌组织5 cm)病理标本30例;收集胃癌细胞系BGC-823、AGS、MGC-803和SGC-7901,采用qRT-PCR检测胃癌和癌旁组织和细胞中PTEN-long mRNA的表达;将SGC-7901细胞处于对数生长期时进行实验,实验分为对照组(SGC-7901细胞未转染慢病毒)、NC组(SGC-7901细胞转染空白质粒)、PTEN-long-RFP组(将PTEN-Long-RFP转染到的SGC-7901细胞)、si-NC组(转染siP-Rex2a NC)、siP-Rex2a组(siRNA干扰技术对Rex2a进行沉默)和siP-Rex2a+PTEN-long组(将PTEN-long-RFP和siP-Rex2a共同转染到的SGC-7901细胞)。采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫共沉淀(Co-IP)检测P-Rex2a与PTEN-long相互作用,蛋白质印迹法检测SGC-7901细胞中PI3K活性相关蛋白;构建P-Rex2a干扰表达载体,检测siP-Rex2a对细胞增殖和凋亡的影响。结果 胃癌组织中PTEN-long mRNA水平显著低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);胃癌细胞系BGC-823、AGS、MGC-803、SGC-7901中mRNA明显低于胃上皮细胞GES-1,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组和NC组相比,PTEN-Long-RFP组中的胃癌细胞SGC-7901增殖明显降低,凋亡能力显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。P-Rex2a与PTEN-long可以相互作用,P-Rex2a过表达可以增强P-Rex2a与PTEN-long的结合;当P-Rex2a蛋白水平随着时间增加时,PTEN-long的蛋白水平逐渐降低。培养后48~96 h,与对照组和si-NC组相比,siP-Rex2a组中的胃癌细胞SGC-7901增殖明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组和si-NC组相比,siP-Rex2a组中的胃癌细胞SGC-7901凋亡能力显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组和si-NC组相比,siP-Rex2a组中的P-Akt、P-PI3K、Bcl-2显著降低,Caspase3、PARP、Bax、Bad明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。培养后48~96 h,与对照组和si-NC组相比,siP-Rex2a组中的细胞增殖率明显降低;与siP-Rex2a组相比,siP-Rex2a+PTEN-long组中培养后48~96 h的细胞增殖率显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组和si-NC组相比,siP-Rex2a组中的细胞凋亡率明显升高;与siP-Rex2a组相比,siP-Rex2a+PTEN-long组中的细胞凋亡率显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PTEN-long参与胃癌的发生和发展,干扰P-Rex2a可以促进PTEN-long表达从而抑制胃癌细胞SGC-7901增殖,促进其凋亡,有望成为胃癌潜在治疗的新靶标。

长链非编码RNA PTENP1通过miR-3611/PTEN基因途径调控宫颈癌进程的分子机制研究

目的 探讨长链非编码RNA PTENP1 (以下简称“PTENP1”)在宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。方法 选取2019年1月至2022年12月海南省妇女儿童医学中心诊断的54例的癌组织与癌旁组织,另选取宫颈癌细胞系(HeLa、SiHa、C33A、Caski)和正常宫颈上皮细胞系(H8),采用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法检测PTENP1、miR-3611、PTEN基因、PTEN蛋白水平。选取合适的宫颈癌细胞系,比较PTENP1在细胞质和细胞核中的表达情况,并进一步将其分为空白组(无处理)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-PTENP1组(转染pcDNA3.1-PTENP1)、NC组(阴性对照,转染模拟物或抑制剂NC)、miR-3611抑制剂组(转染miR-3611抑制剂)、pcDNA3.1-PTENP1+NC组(转染pcDNA3.1-PTENP1和NC)和pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics组(转染pcDNA3.1-PTENP1和miR-3611模拟物)。比较空白组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-PTENP1组PTENP1、miR-3611、PTEN基因、PTEN蛋白及上皮间质转化的相关指标,采用细胞活力检测及流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡情况;比较空白组、NC组、miR-3611抑制剂组miR-3611、PTEN基因、PTENP1水平;比较pcDNA3.1-PTENP1+NC组和pcDNA3.1-PTENP1+miR-361 1 mimics组的细胞增殖情况及上皮间质转化的相关指标。采用双萤光素酶报告基因及RNA下拉实验验证miR-3611与PTENP1、PTEN基因的靶向关系。结果 癌组织PTENP1、PTEN基因、PTEN蛋白水平低于癌旁组织,miR-3611水平高于癌旁组织(P<0.05)。HeLa、SiHa、C33A、Caski细胞PTENP1、PTEN基因、PTEN蛋白水平低于H8细胞,miR-3611水平高于H8细胞(P<0.05),后续实验选择HeLa、Caski细胞进行,PTENP1在HeLa、Caski细胞质中高表达。pcDNA3.1-PTENP1组PTENP1、凋亡率、上皮钙黏素、PTEN基因高于空白组,细胞增殖活力(培养48、72、96h)及ZEB1、Snail、波性蛋白、miR-3611低于空白组(P<0.05)。miR-3611抑制剂组miR-3611低于空白组,PTEN基因、PTENP1高于空白组(P<0.05)。pcDNA3.1-PTENP1+miR-361 1 mimics组细胞增殖活力(培养48、72、96 h)、上皮钙黏素低于pcDNA3.1-PTENP1+NC组,ZEB1、Snail、波性蛋白高于pcDNA3.1-PTENP1+NC组(P<0.05)。野生型miR-3611转染生物素标记的HeLa、Caski细胞的PTENP1水平高于转染生物素标记的空白细胞和突变型miR-3611转染生物素标记的细胞,分别转染PTENP1或PTEN野生型和miR-3611模拟物的293T细胞的相对萤光活性低于仅转染PTENP1或PTEN野生型的293T细胞(P<0.05)。结论 PTENP1通过竞争性结合miR-3611调控PTEN表达影响宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。

长链非编码RNA KUCG1通过MAGEA11调节PTEN/AKT/mTOR途径促进ccRCC舒尼替尼的耐药性

目的:探究长链非编码RNA(lncRNA)KUCG1在肾癌舒尼替尼耐药中的作用。方法:qPCR检测舒尼替尼耐药的肾癌细胞KUCG1表达变化。CCK-8、侵袭实验和流式细胞术分析KUCG1对肾癌细胞增殖、侵袭、凋亡和耐药性的影响。Western blot分析KUCG1对PTEN/AKT/mTOR通路的影响。qPCR检测KUCG1周围基因变化,并研究MAGEA11对肾癌细胞生物学行为的影响。结果:与正常肾癌细胞相比,耐药的肾癌细胞KUCG1表达明显下降。体外试验结果显示,KUCG1表达下调后细胞增殖、侵袭和耐药性增强,凋亡受抑制。KUCG1表达下调可抑制PTEN表达,激活AKT/mTOR通路。KUCG1下调可通过上调其周围MAGEA11表达,抑制PTEN表达,激活AKT/mTOR通路。MAGEA11下调后肾癌细胞增殖、侵袭能力下降,凋亡增强。结论:KUCG1表达下调通过上调MAGEA11表达调节PTEN/AKT/mTOR通路,促进ccRCC舒尼替尼耐药,有望成为ccRCC分子靶向药物耐药的预后标志物和潜在治疗靶点。

LncRNA-GAS5在食管鳞癌中的表达及其对细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨长链非编码核糖核酸生长组织特异性转录体5(LncRNA-GAS5)在食管鳞癌组织中的表达及其对食管鳞癌细胞株EC9706细胞增殖、凋亡的影响。方法:选取2016年2月至2019年1月于中国人民解放军陆军第958医院诊治的食管鳞癌患者78例,比较LncRNA-GAS5在食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达差异;过表达质粒(pEGFP-C1-GAS5)转染EC9706后通过CCK-8试剂盒以及平板克隆试验检测LncRNAGAS5过表达对细胞增殖能力的影响,采用Annexin V/PI双染流式细胞术检测LncRNA-GAS5过表达对细胞凋亡的影响,荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)及蛋白质免疫印迹法检测抑癌基因PTEN表达变化。结果:与癌旁组相比,食管鳞癌组LncRNA-GAS5相对表达量降低(P<0.05);与空白组、阴性对照组相比,pEGFP-C1-GAS5组LncRNA-GAS5相对表达量升高(P<0.05);与空白组、阴性对照组相比,pEGFP-C1-GAS5组转染后48、72、96 h OD值、细胞克隆数降低(P<0.05),p EGFP-C1-GAS5组细胞凋亡率升高(P<0.05),PTEN mRNA、PTEN蛋白表达升高(P<0.05)。结论:食管鳞癌患者癌组织内LncRNA-GAS5低表达,LncRNA-GAS5过表达抑制癌细胞增殖,促进癌细胞凋亡,可能是通过促进抑癌基因PTEN表达实现的。