PTHLH基因对水牛卵泡颗粒细胞活性的影响及其分子调控机制的初步研究

试验旨在探讨PTHLH基因过表达对水牛卵泡颗粒细胞活性的影响,以及PTHLH基因对增殖、表观修饰和多能性相关基因表达模式的调控作用,为理解卵泡颗粒细胞和卵泡发育的分子调控机制提供新的视角。采用脂质体转染法将PTHLH基因过表达载体转染到水牛卵泡颗粒细胞中;利用MTT细胞活性检测试剂测定细胞活性;用STRING在线分析PTHLH及相关蛋白的互作网络;用qRT-PCR检测转染后水牛卵泡颗粒细胞中增殖、表观修饰和多能性相关基因的表达情况,分析PTHLH基因过表达对水牛卵泡颗粒细胞相关基因表达的影响。结果显示,PTHLH基因过表达极显著降低了水牛卵泡颗粒细胞的活性(P<0.0001);过表达组细胞中增殖相关基因(CCNB1、CCND1、CDKN1B、CDKN1A和CDK2)的表达极显著下调(P<0.0001);甲基化相关基因DNMT1和羟甲基化相关基因TET3的表达极显著下调(P<0.001或P<0.01),甲基化相关基因DNMT3B和IDH1的表达显著下调(P<0.05),而羟甲基化相关基因TET1和TET2的表达显著上调(P<0.05);乙酰化相关基因(HDAC1、HDAC2、HAT1、P300和CBP)的表达极显著下调(P<0.001或P<0.0001);与此同时,多能性相关基因OCT4和SOX2的表达极显著上调(P<0.01或P<0.001),而NANOG基因的表达极显著下调(P<0.01)。综上,PTHLH基因过表达抑制了水牛卵泡颗粒细胞的细胞活性,对增殖相关基因(CCNB1、CCND1、CDKN1B、CDKN1A和CDK2)、甲基化相关基因DNMT1与羟甲基化相关基因TET3、乙酰化相关基因(HDAC1、HDAC2、HAT1、P300和CBP)和多能性相关基因NANOG的表达具有负调控作用,而对羟甲基化相关基因TET1和TET2,以及多能性相关基因OCT4和SOX2的表达具有正调控作用。

水牛PTHLH基因克隆分析及其真核表达载体构建

为揭示甲状旁腺激素样激素(parathyroid hormone-like hormone,PTHLH)基因对水牛繁殖性能的影响,本研究对水牛PTHLH基因进行克隆,并对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析。以牛PTHLH基因为种子序列(GenBank登录号:NM_001290949),应用CE Design软件设计引物序列,运用PCR扩增和测序技术获得水牛完整编码区序列,使用DNAMAN、ProtParam、SOPMA、PSORTⅡPrediction等在线软件分析PTHLH蛋白的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性比对分析及系统进化树构建。结果显示,试验克隆了水牛PTHLH基因完整编码区序列,该序列长为534bp,可编码177个氨基酸。水牛PTHLH基因编码区核苷酸序列与黄牛、猪、马、山羊、绵羊和骆驼的同源性分别为98.3%、90.4%、90.1%、98.1%、97.5%和89.2%,物种之间同源性较高,系统进化树分析结果与其亲缘关系远近一致,表明水牛PTHLH基因编码区在进化过程中比较保守。蛋白理化性质分析显示,水牛PTHLH蛋白分子式为C895H1451N271O266S2,分子质量为2 885u,半衰期为30h,理论等电点(pI)为10.00,水溶液在280nm处的消光系数为23 950,肽链N端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为60.04,属于碱性不稳定蛋白;脂肪系数为72.15,总平均亲水性为-0.928,该蛋白属于不可溶性蛋白,亚细胞定位于细胞核、细胞质和线粒体。结构域预测结果显示,水牛PTHLH蛋白包含有1个PTH区域,同时还包含有1个低复杂度区域。二级结构分析显示,水牛PTHLH蛋白包含83个α-螺旋(46.89%)、17个延伸链(9.60%)、10个β-转角(5.66%)和67个无规则卷曲(37.85%),与三级结构预测结果相一致。试验构建了PTHLH基因真核表达载体pcDNA3.1-PTHLH,并通过电泳和测序验证了载体的准确性。PTHLH基因的成功克隆及其真核表达载体的成功构建为今后研究水牛PTHLH基因的功能和遗传特性提供了材料。

PTHLH在鼻咽癌细胞系及组织中表达上调

目的检测PTHLH在鼻咽癌细胞系及组织中的表达水平,从理论上初步探讨其在鼻咽癌发生发展过程中所起的作用。方法实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTHLH在7个鼻咽癌细胞系的表达情况,RT-PCR检测PTHLH在鼻咽癌及非癌鼻咽组织中的表达,免疫组化鉴定其在鼻咽癌及鼻咽上皮组织中蛋白水平的表达。结果PTHLH在鼻咽癌细胞系中的表达上调,以HONE1细胞中表达最高。RT-PCR分析显示PTHLH mRNA在鼻咽癌组织中表达明显上调(61.1%),免疫组化检测鼻咽癌石蜡标本(49例)发现,PTHLH蛋白在鼻咽癌组织中表达明显高于鼻咽上皮组织(12例)(P<0.001)。结论PTHLH基因在鼻咽癌细胞及组织中表达增高,提示其可能参与了鼻咽癌的发生发展,有望成为分子生物学诊断的靶点。

一个短指症E2型伴肥胖症家系的致病基因鉴定及遗传学分析

目的鉴定1个短指症伴肥胖症家系的致病基因,为遗传咨询和产前诊断提供依据。方法先证者为郑州大学附属儿童医院内分泌遗传代谢科收治的1例临床和X线片初诊为短指症E2型伴肥胖症患儿,应用外显子捕获结合二代测序技术对先证者致病基因筛查,采用Sanger测序方法对家系进行验证和遗传分析。结果先证者PTHLH基因第1外显子发现c.125A>C错义突变,导致谷氨酰胺变为脯氨酸(p.Gln42Pro)。该杂合突变在人类基因突变数据库未见报道,SIFT (0)和PolyPhen (0.999)程序评估其可能有害。Sanger测序结果与二代测序结果一致,证实先证者的c.125A>C杂合突变来自其母亲,其舅舅和妹妹也携带相同杂合突变,但其父亲该位点无突变。结论PTHLH基因c.125A>C错义突变可能是该家系致病突变位点。