鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体

[目的]分离、鉴定大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞,克隆甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrp)基因并构建真核表达载体pEGFP-IRES2-PTHrp。[方法]Percoll不连续密度梯度离心法分离生长板增殖区软骨细胞,用X型胶原抗体和电镜鉴定,提取总RNA,RT-PCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA,插入pCR2·1TA克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRES2。[结果]分离出增殖区软骨细胞,经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。[结论]准确分离增殖区软骨细胞并成功构建了PTHrp基因的真核表达载体,为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了基础。

PTHrP基因靶向RNA干扰重组表达质粒的构建鉴定以及在HTB-94细胞中的功能检测

目的构建针对目的基因PTHrp的pSilencer3.1-H1neo siRNA(small interfering RNA)表达质粒,并在人体软骨肉瘤细胞HTB-94中观察其干扰效果。方法设计并合成针对PTHrP基因编码区的含有发卡结构的互补的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BamHⅠ,HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1H1neo中,对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定。结果双酶切证实PTHrP siRNA表达质粒克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致,同时干扰了PTHrP基因的mRNA和蛋白的表达。结论成功构建的靶向RNA干扰重组表达质粒,可以通过小RNA序列干扰靶向基因的mRNA转录,降低靶向基因在细胞中mRNA和蛋白的表达。

实验性咬合紊乱对大鼠髁突软骨中PTHrP及其受体PTH1R表达的影响

目的:探讨实验性咬合紊乱致大鼠髁突软骨异常改建过程中PTHrP及其受体PTH1R的表达变化情况。方法:在8周龄SD大鼠第二、三磨牙之间填塞正畸用橡皮筋推第三磨牙向远中移动,8周后取双侧颞下颌关节,苏木精-伊红染色观察组织形态变化,免疫组化及RT-PCR方法检测PTHrP及其受体PTH1R表达情况。结果:实验组髁突软骨后部明显增厚(P=0.032),且出现典型退行性变,软骨中PTHrP(P=0.034)及PTH1R(P=0.031)的mRNA表达明显低于空白对照组。结论:PTHrP及其受体PTH1R参与实验性咬合紊乱所致髁突软骨异常改建。

益肾化痰法对乳腺癌骨转移患者血液PTHrP、FGF-β、BSP水平的影响及作用机制分析

目的:分析益肾化痰法方对乳腺癌骨转移患者血清血液PTHrP、FGF-β、BSP水平的影响及作用机制。方法:以河南中医药大学第三附属医院收治的乳腺癌骨转移患者90例为研究对象,采取数字表随机分组法分为观察组与对照组各45例,对照组实施常规乳腺癌骨转移治疗方法,观察组以对照组为基础使用益肾化痰方,对比两组患者血液PTHrP、FGF-β、BSP水平改变与差异及不良反应发生率。结果:干预前两组的PTHrP细胞阳性率无明显差异,P>0.05,干预后两组患者阳性率均降低,但观察组阳性率(69.42±3.12)%低于对照组(77.53±4.01)%,两组相比P<0.05;干预前两组患者的FGF–β细胞阳性指数无明显差异,P>0.05,干预后两组的细胞阳性指数均下降,但观察组的阳性指数(5.02±0.94)分低于对照组(6.80±0.82)分,两组相比P<0.05;干预前两组的BSP细胞阳性率无明显差异,P>0.05,干预后两组患者阳性率均降低,但观察组阳性率(61.31±6.45)%低于对照组(70.40±6.10)%,两组相比P<0.05;观察组患者的治疗不良反应发生率低于对照组(28.98%VS 53.33%),两组相比P<0.05。结论:乳腺癌骨转移患者常规治疗基础上加用益肾化痰方能够有效改善患者的血液PTHrP、FGF-β、BSP水平,对抗骨转移症状,并降低不良反应发生率,其机制与益肾化痰方改善肾虚骨髓空虚及药物有效成份可抑制骨破坏增加骨形成及改善免疫功能有关。

辛伐他汀对PTHrP诱导的破骨细胞性骨吸收及小鼠颅盖骨代谢的影响

[目的]探讨辛伐他汀对体外甲状旁腺素相关肽(PTHrP)诱导小鼠的破骨细胞骨吸收功能的作用及其小鼠骨代谢的影响。[方法]采用PTHrP诱导小鼠骨髓细胞培养破骨细胞和小鼠颅盖骨培养体系,检测辛伐他汀作用8 d后破骨细胞骨吸收陷窝和培养上清钙的变化;检测小鼠颅盖骨培养上清碱性磷酸酶和钙含量,组织学观察小鼠颅盖骨形态学变化。[结果]辛伐他汀体外可明显抑制PTHrP诱导小鼠的破骨细胞骨吸收陷窝的形成及培养上清钙的释放,辛伐他汀体外可增强小鼠颅盖骨培养上清碱性磷酸酶的活性,组织学观察到辛伐他汀使小鼠颅盖骨矿化增强。[结论]辛伐他汀体外不仅可促进小鼠颅盖骨的成骨活性,并且可明显抑制PTHrP诱导小鼠的破骨细胞骨吸收功能,对骨吸收性疾病有着重要的防治作用。

实验性单侧前牙反修复体对大鼠髁突软骨中甲状旁腺激素相关蛋白和PTH/PTHrP受体-1表达的影响

目的探讨实验性单侧前牙反修复体对大鼠髁突软骨中甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)及PTH/PTHrP受体-1(PTH1R)表达的影响。方法在6周龄SD大鼠左侧上、下切牙粘接金属不良修复体,使其呈反关系,2、4、8周后取颞下颌关节(TMJ),苏木精-伊红(HE)染色观察组织形态学变化,免疫组织化学染色及实时定量聚合酶链反应检测PTHrP、PTH1R的表达情况。结果 8周时,实验组髁突软骨出现明显退行性变,PTHrP阳性细胞较对照组显著增多(P<0.01),PTH1R阳性细胞明显减少(P<0.01);实验组髁突软骨PTHrP mRNA的表达显著高于对照组(P<0.01),而PTH1R mRNA表达明显降低(P<0.01)。结论髁突软骨PTHrP的高表达因PTH1R的低表达不能有效发挥作用,可能是髁突软骨骨关节病样变的重要分子机制之一。

Ihh-PTHrP信号轴介导髁突软骨细胞对压力微环境改变的调控研究

目的 探究Ihh-PTHrP负反馈信号通路与静压力下髁突软骨细胞生物学响应的关系。方法 体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,100 kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3、4 h的加压处理;采用Western印迹的方法比较分析髁突软骨细胞COL2A1、Ihh和PTHrP的蛋白表达变化;通过RT-qPCR检测分析静压力对Ihh和PTHrP基因水平表达的影响;选取0 h和3 h组,使用扫描电子显微镜扫描分析静压力对髁突软骨细胞形态的影响;采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果 Western印迹实验发现：压力加载3 h后,COL2A1出现明显高表达;Ihh蛋白表达在0-2 h内逐渐升高,在2-4 h内却逐渐降低;PTHrP在0-2 h内蛋白表达逐渐升高,并在2-4 h内维持着一个较高水平的表达。RT-qPCR检测发现Ihh在压力加载1 h时出现明显高表达,而PTHrP则在2 h时出现明显高表达。100 kPa静压力加载3 h后,髁突软骨细胞突起增多、变长。结论 兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力;适宜的静压力可以提高髁突软骨细胞的成软骨能力;Ihh-PTHrP负反馈信号通路参与髁突软骨细胞对压力微环境改变的适应性改建过程。

PTHrP在乳腺癌及其骨转移中的表达及意义

目的:检测PTHrP在乳腺癌与骨转移性乳腺癌中的表达,探讨PTHrP在乳腺癌及其骨转移发生发展过程中的作用。方法:采用免疫组化SP二步法检测64例乳腺增生症及不同乳腺癌组织中PTHrP蛋白的表达。结果:PTHrP在乳腺增生症中基本不表达,在无骨转移的乳腺癌中表达明显低于伴有骨转移的原发乳腺癌以及骨转移性乳腺癌(P<0.05);伴有骨转移的原发乳腺癌与骨转移性乳腺癌PTHrP表达差异具有统计学意义(P<0.05);PTHrP在乳腺癌中的表达与年龄、肿瘤类型、PR、CerbB-2表达无关,与肿瘤的组织学分级、ER表达相关。结论:PTHrP可能参与乳腺导管上皮细胞的恶性转化并与乳腺癌骨转移有关。

PTHrP1-34对荷瘤小鼠骨代谢及骨生物力学作用的观察

目的研究荷瘤小鼠在甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP1-34）的作用下，骨代谢及骨生物力学等指标的变化，同时观察肿瘤生长情况。方法对照组、模型组、实验组4W龄健康雌性BALB／c小鼠各12只，模型组和实验组采用乳腺癌组织块悬浊液注射法制备小鼠乳腺癌模型，10d后模型组每日予以生理盐水腹腔注射，实验组每日予以PTHrP1-34400μg／kg体重腹腔注射。用药35d后行全身骨X线扫描观察骨破坏情况、测全身骨密度（BMD）、骨生物力学以及骨代谢相关血清指标[血清Ca、P、碱性磷酸酶（ALP）、I型胶原C-末端交联顶端肽β（β-CTX）骨钙素（BGP）、骨唾液酸蛋白（BSP）]，剥离肿瘤比较两组肿瘤的体积与质量。结果X线片显示，与模型组相比，实验组存在明显的溶骨性骨破坏，其中1只存在骨折。与对照组和模型组比较，实验组BMD、生物力学指标显著降低（P〈0．01）。各组Ca水平差异无统计学意义（P〉0．05）；与对照组和模型组比较，实验组P、B—CTX、BSP等反映骨吸收的指标显著升高，总ALP、BGP等反映骨形成的指标均显著降低（P〈0．01或P〈0．05）；与对照组相比，模型组各指标变化差异无显著性。实验组肿瘤体积和质量显著升高（P〈0．01）。结论PTHrP1-34能够促进小鼠乳腺癌骨转移，造成溶骨性骨破坏，骨量下降、骨强度降低，同时骨破坏释放的因子可能促进肿瘤的生长。

Ihh-PTHrP信号轴调控髁突软骨内成骨相关机制的研究进展

Ihh-PTHrP信号轴调控软骨内成骨过程。近年来,国内外学者对Ihh-PTHrP信号通路的调控机制给予了广泛的关注,相关的调控机制屡见报道,对髁突软骨内成骨机制研究的需求日趋迫切。国内外许多文献报道了相关因子在Ihh-PTHrP信号轴中的重要角色,发现了一些具有指导意义的成果。通过对近几年国内外相关文献的总结归纳,对该信号轴调控髁突软骨内成骨的相关机制研究做一综述。

肺癌骨转移血清中CaN和PTHrP测定的结果及意义分析

肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,确诊时多数患者已经处于局部晚期或者转移阶段,其中以骨转移较为多见[1]。肺癌患者骨转移后可造成剧烈疼痛、高钙血症等并发症,还可能因骨质破坏引起病理性骨折、横断性截瘫等严重问题,患者生活质量下降,生存期显著缩短[2]。因此,早期诊断骨转移、并予以积极治疗对于改善肺癌患者预后具有重要意义。但传统的影像学检查手段敏感性较低,确诊是患者的骨质破坏已较严重,不利于早期诊断[3]。

大鼠PTHrP亚基因的克隆及其真核反应质粒的构建

目的:克隆甲状旁腺相关肽(PTHrP)亚基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)并构建四环素反应性元件调控的反应质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139),为调控PTHrP亚克隆在软骨前体细胞中的表达打下基础。方法:提取骨骺干细胞的总RNA,以RT-PCR方法获得带有酶切位点的PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)基因片段,扩增的DNA片段分别与含潮霉素筛选标记的四环素反应性元件载体pTRE-2Hyg双酶切后连接,转化扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定。结果:经酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒。结论:成功克隆出PTHrP亚克隆基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)并构建了反应质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139),为进一步精确调控PTHrP亚基因的表达奠定了基础。

PTHrP1-34片段对去卵巢大鼠骨质疏松作用

目的探讨人甲状旁腺激素相关蛋白1-34片段(human parathyroid hormone related protein,PTHrP1-34)对去卵巢骨质疏松大鼠的作用。方法60只4月龄Wistar健康雌性大鼠,40只行双侧卵巢摘除术,20只做假手术,6周后各处死10只证实骨质疏松造模成功。余30只骨质疏松模型鼠随机分为PTHrP治疗组、雌二醇治疗组(E2组)和安慰剂组(Placebo组),10只假手术组作对照。治疗3个月后,测定并比较股骨、股椎骨密度(BMD)、血清钙、磷、感性磷酸酶(ALP)、雌激素(E2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、骨钙素(BGP)、胰岛素样生长因了(IGF-1)水平。结果治疗后,PTHrP股有和腰椎BMD较Placebo组明显升高;血清BGP及IGF-1水平也明显高于Placebo组;PTHrP治疗组血清TNF-α无明显变化。结论hPTHrP1-34能通过刺激成骨细胞的活性,增加骨密度,对去卵巢大鼠所引起的骨质疏松有效。

RNAi技术沉默PTHrP基因的表达诱导软骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的研究甲状旁腺相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)对软骨肉瘤细胞增殖的影响。方法本实验设置空白对照组、空质粒组和siPTHrP转染组,每组样本数均为6。空白对照组不做处理;分别将空质粒pSilencer3.1H1neo(空质粒组)和重组质粒pSilencer3.1H1neo-siPTHrP(siPTHrP转染组)转染至SW1353软骨肉瘤细胞株,通过MTT法检测各组细胞活力并绘制细胞生长曲线,利用流式细胞技术测定细胞凋亡率,半定量RT-PCR和Western blotting法检测PTHrP基因在mRNA水平及蛋白水平表达上的变化。结果siPTHrP转染组的细胞生长较空白对照组软骨肉瘤细胞明显缓慢;siPTHrP转染组细胞凋亡率明显升高;重组质粒pSilencer3.1H1neo-siPTHrP能明显抑制软骨肉瘤细胞的PTHrP基因在mRNA转录水平和蛋白水平上的表达。结论重组质粒pSilencer3.1H1neo-siPTHrP可明显抑制软骨肉瘤细胞增殖及其内源基因PTHrP在mRNA转录水平和蛋白水平的表达,为PTHrP介导的软骨肉瘤基因沉默疗法提供了理论基础。

山羊PTHrP基因CDs区克隆及其融合蛋白的表达

【目的】克隆山羊甲状旁腺相关肽(Parathyroid hormone related protein,PTHrP)基因,并进行原核表达,获得具有生物学活性的融合蛋白。【方法】无菌采集山羊乳腺组织,采用TRIZOL法提取总RNA,RT-PCR克隆山羊PTHrP基因全CDs区。将山羊PTHrP基因全CDs区插入pET-32a(+)表达质粒构建pET-PTHrP质粒,经酶切和测序鉴定后,将其转化E.coliBL21(DE3)菌株,经2mmol/LIPTG、37℃诱导表达8h后,进行SDS-PAGE和Westernblotting分析。【结果】获得了山羊PTHrP基因全CDs区,长534bp(GenBank登录号GU573787);酶切和测序显示,原核表达载体pET-PTHrP构建成功;SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,在E.coliBL21(DE3)中成功诱导表达了pET-PTHrP融合蛋白。【结论】克隆了山羊PTHrP基因,获得了PTHrP融合蛋白。

前列腺癌患者血清PSA和PTHrP联合检测及临床价值

目的：观察３１例前列腺癌患者血清ＰＳＡ与ＰＴＨｒＰ的关系。方法：用放射免疫分析法（ＲＩＡ）和免疫放射分析法（ＩＲＭＡ）。结果：１）正常组测得血清ＰＳＡ值为２．０±１．４４μｇ／Ｌ（ｘ±ｓ），血清ＰＴＨｒＰ（１～８６）值为１．６±０．６ｐｍｏｌ／Ｌ（ｘ±ｓ）。２）前列腺癌组测得血清ＰＳＡ值为８０±５２．５５μｇ／Ｌ（ｘ±ｓ），ＰＴＨｒＰ测得值为４．５８±４．４０ｐｍｏｌ／Ｌ（ｘ±ｓ），显著高于健康组（ｔ＝２．７４９，Ｐ＜０．０１和ｔ＝２．７５，Ｐ＜０．０１）。３）２１例伴发ＨＨＭ前列腺癌患者，ＰＴＨｒＰ（１～８６）升高的有１３例，占６１．９％（１３／２１），测得均值为７．４ｐｍｏｌ／Ｌ（２．８８～１９．１ｐｍｏｌ／Ｌ）。４）２１例伴发ＨＨＭ前列腺癌患者ＰＳＡ和ＰＴＨｒＰ浓度呈显著正相关（ｒ＝０．８２３，Ｐ＜０．０１）。

运动对Ihh/PTHrP信号通路调控骨形成的影响研究

骨形成主要是通过膜内成骨和软骨内成骨两种方式进行的。膜内成骨侧重于调控骨长粗,而软骨内成骨则负责骨生长。之前大量研究均证实运动有助于骨健康,促进骨形成,而且均致力于膜内成骨,尚鲜有提及软骨内成骨方面。因此,本研究主要从软骨内成骨的角度着手,探讨运动调节Ihh/PTHrP信号通路达到促进软骨内成骨并增加青春期的峰值骨量、促进骨生长的机制。

辛伐他汀对PTHrP诱导破骨细胞形成及小鼠颅盖骨代谢的影响

目的:探讨辛伐他汀对体外甲状旁腺素相关肽(PTHrP)诱导小鼠的破骨细胞骨吸收功能的作用及其小鼠骨代谢的影响。方法:采用PTHrP诱导小鼠骨髓细胞培养破骨细胞和小鼠颅盖骨培养体系,检测辛伐他汀作用8d后破细胞骨数目和培养上清钙的变化;检测小鼠颅盖骨培养上清碱性磷酸酶和钙含量,组织学观察小鼠颅盖骨形态学变化。结果:辛伐他汀体外可明显抑制PTHrP诱导小鼠的破骨细胞骨吸收陷窝的形成及培养上清钙的释放,辛伐他汀体外可增强小鼠颅盖骨培养上清碱性磷酸酶的活性,组织学观察到辛伐他汀使小鼠颅盖骨矿化增强。结论:辛伐他汀体外不仅可促进小鼠颅盖骨的成骨活性,并且可明显抑制PTHrP诱导小鼠的破骨细胞骨吸收功能,对骨吸收性疾病有着重要的防治作用。

PTHrP1-34对荷瘤小鼠骨代谢与肿瘤生长情况的影响

目的研究甲状旁腺激素相关蛋白1-34(PTHrP1-34)对荷瘤小鼠骨代谢的影响,同时观察肿瘤生长情况。方法对照组、模型组、实验组4周龄健康雌性BALB/c小鼠各12只,模型组和实验组采用乳腺癌组织块悬浊液注射法制备小鼠乳腺癌模型,10d后模型组每日予以生理盐水腹腔注射,实验组每日予以PTHrP1-34400μg/(kg.bw)腹腔注射。用药35 d后测全身骨密度(BMD)、股骨灰干重比、骨代谢相关血清指标[钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、Ⅰ型胶原C-末端交联顶端肽β(β-CTX)、骨唾液酸蛋白(BSP)],剥离肿瘤比较体积与质量。结果各组Ca水平差异无显著性(P>0.05)。与对照组和模型组比较,实验组P、β-CTX、BSP等反映骨吸收的指标显著升高(P<0.01或P<0.05),总ALP、BGP等反映骨形成的指标显著降低(P<0.01或P<0.05);实验组BMD、股骨灰干重比均显著降低(P<0.01)。与对照组相比,模型组各指标变化差异无显著性。实验组肿瘤体积和质量显著升高(P<0.01)。结论在PTHrP1-34的作用下,荷瘤小鼠骨吸收大于骨形成,造成溶骨性骨破坏,骨密度降低,骨破坏释放的细胞因子可能促进肿瘤生长。

PTHrP信号途径在软骨内成骨过程中的作用

生长板软骨细胞经历增殖、分化、肥大和软骨基质矿化等过程 ,提供了长骨线性生长的模型。软骨细胞的有序分化需要甲状旁腺激素相关肽 (PTHrP)的调节。PTHrP除以PTH样作用引起恶性肿瘤高钙血症外 ,其另一重要作用是与Ihh信号分子构成一个旁分泌环路调节生长板软骨细胞的分化和骨骼形态发生。PTHrP主要由软骨膜或早期软骨细胞产生 ,对生长板增殖带软骨细胞的分化成熟起抑制作用 。