微滴数字PCR检测含有目的基因的PUC57质粒问题分析

目的探讨微滴数字聚合酶链反应(ddPCR)检测含有目的基因的PUC57质粒过程中出现的问题及解决方法。方法用ECORⅠ酶37℃孵育含有目的基因的PUC57质粒2h和4h,然后65℃孵育20min,灭活ECORⅠ酶。用伯乐QX200TM微滴式数字PCR分别检测PUC57质粒和经ECORⅠ酶酶切后的PUC57质粒,同时对酶切后的PUC57质粒分多天进行检测,对检测结果进行比较。结果含有目的基因的PUC57质粒经ECORⅠ酶酶切2h和4h后的检测值与质粒理论值之间差异无统计学意义(t=-0.192、-0.403,P>0.05),同时酶切与没有酶切的PUC57质粒检测值之间差异有统计学意义(Z=-4.194,P<0.05)。酶切后的检测值与PUC57质粒理论值相符合。酶切后的PUC57质粒随着放置时间的延长,检测值逐渐降低。结论用伯乐QX200^(TM)微滴式数字PCR检测含有目的基因的PUC57质粒时要先酶切再检测,酶切时间只需2h即可将质粒酶切完全,同时酶切的PUC57质粒要尽快检测。

原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN的构建及鉴定

目的:合成基因CTP及PTEN基因,构建其原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN,为后续研究其功能做准备。方法:合成基因CTP-PTEN,将该基因定向克隆到原核表达载体pUC57中,构建pUC57-CTP-PTEN重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒进行双酶切、测序鉴定后,用Western blotting检验表达。结果:测序鉴定CTP-PTEN基因合成成功。经双酶切、测序鉴定证实重组质粒pUC57-CTP-PTEN成功转入DH5α,Western blotting检验pUC57-CTP-PTEN成功表达。结论:成功构建了重组质粒pUC57-CTP-PTEN,并在大肠杆菌DH5α中成功表达。

LMP-1与LMP-3真核双表达质粒的构建及体外表达

目的:构建真核双表达质粒pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3,并检测其在体外的表达。方法:采用人工设计合成人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)和LIM矿化蛋白-3(LIM mineralization protein-3,LMP-3)基因片段,分别连接于中介质粒Puc57,经酶切、测序鉴定后,LMP-1和pBudCE4.1先连接,经酶切鉴定,再连接LMP-3,重组双表达质粒行酶切、测序鉴定。用脂质体包裹转染骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染LMP-1基因组(C组)、转染LMP-3基因组(D组)、转染LMP-1和LMP-3双基因组(E组)。采用RT-PCR和Western blot检测LMP-1和LMP-3的表达。结果:酶切及测序证实质粒Puc57-LMP-1、Puc57-LMP-3及其pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3真核双表达质粒构建成功。该双表达质粒在体外转染骨髓MSCs后可表达LMP-1和LMP-3分子。对RT-PCR及Western blot检测结果行灰度值测量显示:LMP-1 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.05),C组与E组差异无统计学意义(P>0.05);LMP-3 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.001),D组与E组差异有统计学意义(P<0.05),C组及D组在LMP-1及LMP-3的表达上的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建真核双表达质粒pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3,证实转染的骨髓MSCs能在体外同时表达LMP-1和-LMP-3分子。

pNZ8149-IL21基因乳酸菌表达载体的构建与表达特性

构建重组质粒pNZ8149-IL21,并将其转到乳酸球菌中,利用Nisin诱导基因表达系统分析重组质粒在乳酸球菌中的表达。采用基于聚合酶链式反应的精确合成(PCR-based accurate synthesis,PAS)的方法,合成目的基因IL21,连入载体pUC57,获得重组质粒pUC57-IL21;对含有目的基因的pUC57-IL21和pNZ8149质粒进行双酶切后,构建pNZ8149-IL21质粒;采用电转化方法将连接产物转化进NZ3900,涂板挑取12个单菌落培养后,进行PCR验证,筛选出阳性克隆,从诱导剂Nisin的浓度(30,50和100 ng/m L)和诱导时间(12和24 h)进行诱导条件优化分析IL21在乳酸菌中表达。目的蛋白在乳酸菌NZ3900中得到表达,在50 ng/m L的Nisin诱导24 h可见目的蛋白在相对分子质量15 k左右有条带表达,Nisin诱导24 h的效果优于12 h。结果说明选择乳酸菌作为载体表达系统,构建IL21高表达的重组乳酸菌是可行的。