牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。

抗PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可应用于猪圆环病毒4型(PCV4)候选疫苗特异性抗体检测与评价方法,本研究应用PCV4 Cap蛋白作为抗原,以PCV4多克隆兔源抗体作为一抗,优化各反应的最佳条件并建立了针对PCV4 Cap蛋白抗体的间接ELISA方法。最佳条件为2μg/m L PCV4 Cap纯化蛋白,4℃包被过夜,5%脱脂乳封闭60 min,待检血清稀释比例为1∶800,反应条件为37℃、45 min,酶标抗体稀释比例为1∶5000,反应条件为37℃、60 min,底物显色时间为10 min,Cut of f值为0.157,灵敏度可达102400倍。成功建立的抗PCV4Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、重复性和特异性。可为检测PCV4候选疫苗的特异性抗体水平提供一种精准、高效的方法。

基于Penton蛋白禽腺病毒血清4型间接ELISA抗体检测方法的建立

Penton蛋白是构成禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)衣壳的主要结构蛋白,具备高度保守性与良好的免疫原性。以纯化的Penton蛋白为包被抗原,建立一种基于禽腺病毒血清4型Penton蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,Penton蛋白最佳包被质量浓度为2μg/mL,血清稀释倍数为200倍,酶标抗体稀释倍数为1∶5000,阳性临界值为0.222,敏感性可达到1∶6400,与鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒均无交叉反应,特异性良好,批间批内重复性变异系数均<10%,在100份临床血清中阳性检出率为77%,与商品化试剂盒检出符合率可达98%。综上,建立的ELISA抗体检测方法可以用于禽腺病毒4型临床抗体检测。

猪胞内劳森菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

猪增生性肠病(PPE),通常被称为猪回肠炎(PI),由胞内劳森氏菌(LI)感染引起。为建立检测LI抗体的间接ELISA方法,本研究构建LI外膜蛋白基因(LI0841)的重组表达质粒p ET28a-LI0841,经测序无误后转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE检测重组蛋白LI0841蛋白(rLI0841)的表达形式,经Ni柱纯化后采用western blot鉴定其反应原性。SDS-PAGE结果显示,在32 ku处出现目的条带,且其主要以可溶性形式表达;western blot结果显示,r LI0841能够与兔LI多克隆抗体特异性反应,表明纯化的r LI0841具有较强的反应原性,可作为包被抗原用于建立间接ELISA检测方法,经各反应条件优化初步建立LI抗体的间接ELISA检测方法。各反应条件的优化结果显示,4.38 ng/孔的r LI0841以4℃过夜包被最佳;血清最佳稀释度为1∶100,37℃反应0.5 h;羊抗猪Ig G-HRP最佳稀释度为1∶10000,37℃作用0.5 h;TMB底物37℃显色15 min。利用建立的间接ELISA方法检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌及经美国Biostone PPE抗体检测试剂盒检测为阳性的猪血清,评估该方法的特异性;将LI阳性血清2倍倍比稀释(1∶100~1∶51200)后,采用本研究建立的间接ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;以同一批次和不同批次包被的酶标板分别检测5份不同LI抗体水平的猪血清,评估该方法的重复性。结果显示,该方法除能检测到LI阳性血清外,其余相关病原的阳性血清均为阴性,特异性较强;LI阳性血清1∶800稀释时检测结果仍为阳性,敏感性较高;对5份不同抗体水平的LI阳性血清的批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性较好。利用该ELISA方法与美国Biostone公司PPE抗体检测试剂盒同时检测104份临床猪血清样品,比较二者的检测结果,并计算二者的符合率;采用建立的间接ELISA方法检测黑龙江、吉林等地区413份临床猪血清样品,分析LI在上述地区的流行状况。结果显示,两种方法的阳性符合率为90.91%,阴性符合率为91.84%,总符合率为91.35%;413份临床猪血清样品中LI的阳性检出率为59.81%(247/413),表明LI在黑龙江、吉林等地区的猪群中普遍存在。本研究建立了检测LI抗体的间接ELISA方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性与准确性均较好,为临床PI血清流行病学调查提供技术支持。

新型鹅星状病毒ORF2蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立检测新型鹅星状病毒(Goose Astrovirus,GAstV)抗体快捷特异方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了GAstV重组ORF2蛋白,并以纯化的ORF2蛋白作为包被抗原,通过反应条件的摸索,建立了一种检测GAstV抗体的间接ELISA方法。经特异性和重复性试验证明,建立的间接ELISA仅与GAstV阳性血清反应,而与其他鹅易感病毒的阳性血清无交叉反应,且批间和批内重复性变异系数均低于10%;在灵敏度分析中,ELISA检测的灵敏度可达IFA的4倍;临床样品检测结果显示,该ELISA方法与IFA检测的符合率达89.8%。上述结果表明,本研究在杆状病毒中成功表达了GAstV的ORF2蛋白,且建立了具有良好的特异性、敏感性和重复性的间接ELISA方法,为GAstV的临床感染检测和血清学流行病学调查提供了一种准确、快速和经济的检测方法,为开发临床适用的检测试剂盒提供了参考。

猪急性腹泻综合征冠状病毒S1蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法,本研究通过构建重组真核分泌型表达质粒p CAGGS-S1-His并转染HEK293F悬浮细胞进行可溶性表达S1蛋白。转染重组质粒5 d后的细胞上清利用HisTrapTMExcel亲和层析柱纯化,浓缩后的蛋白经SDS-PAGE、western blot鉴定显示获得了分子量约为130 ku且大于理论大小的重组S1蛋白,表明该蛋白为分泌表达且具有良好的翻译后修饰。利用获得的重组S1蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,初步建立了SADS-CoV S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法。该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清均无交叉反应,仅与SADS-CoV阳性血清反应,表明该方法特异性较强;该方法检测SADS-CoV阳性血清,当稀释至1:3 200时仍为阳性,表明该方法具有较高的敏感性;对4份阳性血清的批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法具有良好的重复性和稳定性;利用该方法和间接免疫荧光试验(IFA)对50份临床样品检测,结果显示该间接ELISA检测到9份阳性样品,41份阴性样品;IFA检出5份阳性样品,45份阴性样品,二者的总符合率为92%。综上表明,本研究建立的间接ELISA检测方法能够特异、灵敏地检测SADS-CoV S1蛋白抗体,可以用于SADS-CoV灭活疫苗的免疫效果评价以及该病原的血清学流行病学调查和免疫水平监测,为SADS-CoV所致疫病的鉴别诊断和防控奠定基础。

猪细环病毒1型间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪细环病毒1型抗体的血清学方法。【方法】以猪细环病毒1型衣壳蛋白为包被抗原,筛选和优化抗体检测反应条件来建立一种检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,之后进行特异性和重复性试验,并进行初步临床应用检测。【结果】确定了检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法的各项最佳反应条件;对8种猪源病毒阳性血清的检测结果显示只有猪细环病毒1型阳性血清为阳性,显示出良好的特异性;批内变异系数均小于5%,批间变异系数均小于10%,显示出良好的重复性。对来源于北京和湖南地区的400份猪血清样品的检测结果显示,猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体阳性率为75.25%,PCR阳性率为71.00%,二者之间没有显著差异(P>0.05),表明这两个地区存在较多的的猪细环病毒1型感染。【结论】建立了一种特异性和重复性都良好的检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA,可用于猪细环病毒1型抗体的临床检测。

非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在不同温度保存下对实验结果的影响

目的:比较非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在不同低温保存下对检测结果的影响。方法:将同一生产厂家同一批号的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒分别置于4℃和-18℃下保存24 h以上后对养殖场送检的12份猪血清样品进行检测,比较其OD值和结果差异。结果:这两种储存温度下的实验均成立且判定结果一致,但OD值存在一定的偏差。

鸡毒支原体抗体间接ELISA检测技术的应用

该文主要探究ELISA检测试剂盒在鸡毒支原体检测中的应用。使用血清样品、鸡毒支原体菌株和SPF鸡等作为实验材料,分别进行灵敏性实验、重复性实验、抗体持续期检测、临床样品检测准确性检测和保存期实验。结果表明,ELISA试剂盒的灵敏性较好;重复性实验的稳定性达到预期;鸡在接种弱毒性疫苗后的35 d内,血清中抗体水平有明显上升;临床样品检测准确性较高;在保存期320 d内,ELISA试剂盒内试剂的敏感性和特异性良好。分析可得,使用ELISA试剂盒测试血清中的鸡毒支原体是可行的,并且具有操作简便、成本较低、效率较快的优势。

ELISA检测血清乙肝两对半的影响因素分析

分析ELISA法检测血清乙肝两对半的影响因素。方法:选取2020年05月~2022年03月采用ELISA手工方式检测乙型肝炎两对半的158例患者,针对最终检测结果,探讨相关影响因素。结果:标本凝固等为相关影响因素。结论:ELISA检测乙肝两对半,样本保存等因素会影响检测结果。因此,检验时,需要依据相关操作流程,做好质量控制工作,以提升检验结果的准确性。

三种口蹄疫病毒O型、A型抗体ELISA检测试剂盒的比较分析

目的:比较不同的口蹄疫病毒O型、A型抗体ELISA检测试剂盒的性能差异,为基层兽医实验室选择合适的试剂盒提供参考。方法:采集174份已免疫的猪、羊血清样品,选用3个不同厂家的口蹄疫病毒O型、A型抗体ELISA检测试剂盒进行抗体检测,比较各试剂盒的抗体阳性率、符合率和便捷性。结果:3种试剂盒的口蹄疫病毒O型抗体检测阳性率均在90%以上,符合率为89.66%;3种试剂盒的口蹄疫病毒A型抗体检测阳性率为56.90%95.98%,差别较大,符合率仅52.87%。结论:3种口蹄疫病毒O型、A型抗体ELISA检测试剂盒的检测结果存在一定差异,且差异具有统计学意义(P<0.05);3种试剂盒均适用于口蹄疫病毒O型抗体的定性测定,不全适用于口蹄疫病毒A型抗体的定性测定。

探讨在梅毒抗体检测中使用ELISA法及胶体金法等两种不同免疫检验方法的价值

分析在梅毒抗体检测中使用ELISA法及胶体金法等两种不同免疫检验方法的价值。方法 选取2022年1月-2024年1月西藏某医院收治的120例疑似梅毒患者,所有患者均依次接受ELISA法和胶体金法检测,以TPPA检测结果为金标准,比较阳性检出率。结果 两种检测方法的检出率、敏感性和特异度无明显差异(P>0.05)。结论 两种检测手段在识别梅毒抗体方面展现出相似的可靠性和效果。针对假阴性现象,可通过联合检测提高阳性检出率,以避免漏诊情况的出现。

乙型肝炎病毒(HBV)的ELISA检测及化学发光法检测的诊断价值

目的 本研究探讨化学发光法与酶联免疫吸附法在(HBV)中的诊断价值。方法 收集本院2020年6月—2023年4月收治的300例乙型病毒性肝炎病例的血标本为观察组,另随机选择同期住院的300例非乙型病毒性肝炎病例的血标本为对照组。两组均采用HBV的ELISA检测及化学发光法检测,对比两组检测结果。结果化学发光法对HBV的标准曲线相关系数R2=0.998,平均批内变异系数2.98%,批间变异系数4.20%,优于ELISA检测的平均批内变异系数6.27%及平均批间变异系数7.74%;化学发光法的最低检出浓度为2.5ng/mL,ELISA检测乙型肝炎病毒最低检出浓度为25ng/mL,化学发光法灵敏度优于ELISA检测法。ELISA检测阳性率明显低于化学发光法检测结果,阴性率高于化学发光法。结论 化学发光法有利于早期诊断乙型病毒性肝炎,较ELISA检测具有很高的灵敏度与特异度。

牛羊O型口蹄疫ELISA试验的抗体检测

口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的偶蹄类动物传染病,具有传播速度快、感染范围广、危害严重等特点,其中O型口蹄疫是引起口蹄疫的主要病毒类型之一。在疑似病例诊断和鉴别诊断过程中,牛羊O型口蹄疫ELISA试验的抗体检测可以作为一种快速、准确的辅助诊断方法,通过检测待检样本中的特异性抗体水平是否高于临界值,并结合临床症状和其他检查结果综合分析可作出准确判断,同时通过对历史数据的分析,可以预测疫情的发展趋势和流行规律,为制定科学有效的防控策略提供依据,这对于牛羊O型口蹄疫的疫情控制具有重要意义。

ELISA检测中全自动与手工法的对比评价

ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)全称为酶联免疫吸附试验,是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的一项综合性技术,具有灵敏、特异、快速、简便、易于自动化操作等特点。此项技术自20世纪70年代初问世以来,发展十分迅速,目前已广泛应用于生物学和医学科学的许多领域,也是兽医实验室免疫学检验中最常用的方法。

利用RT-PCR与PVP-ELISA检测水稻瘤矮病单头叶蝉

目前国内外对水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)的研究主要集中在其核衣壳蛋白和外衣壳蛋白的性质、结构及其与介体的亲和性、与介体传毒能力的关系等方面,本室在已有室内检测研究的基础上,利用RT-PCR和PVP-ELISA法对田间带毒叶蝉进行检测,并对2种方法的检测结果进行了比较.

猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用

为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法,本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠,按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体,PEDV细胞培养上清为夹心抗原,HRP标记的羊抗猪IgA为二抗,采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法,并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测,结果显示,除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外,其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性,表明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1∶10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测,结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1∶40960,是BIONOTE PEDV IgA试剂盒敏感性的16倍(1∶2560),表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性猪初乳,评估该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数分别为0.34%~4.49%和1.90%~8.71%,均小于10%,重复性好。利用该捕获ELSIA和IDEXX PEDV IgA抗体试剂盒分别对50份猪初乳检测,结果显示两种方法对样品检测的OD450nm值趋势高度一致,表明该方法检测结果与IDEXX试剂盒相关性强。利用该捕获ELISA和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对100份临床采集的猪初乳样品检测,结果显示二者总体符合率为97.0%。利用该方法对90份免疫背景不同的猪初乳检测,结果显示,未感染PEDV且未免疫PED疫苗的母猪初乳检测结果均为阴性结果,感染了PEDV或接种过PED疫苗的母猪初乳均为阳性结果,检测结果与样品的免疫背景相符。本研究建立的捕获ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,与同类进口产品检测结果符合率高,对临床样品的检测结果与其免疫背景相符。本研究为PEDV感染猪初乳的检测及PED疫苗免疫效力的评价提供了一种新的技术手段。

应用LSDV-ELISA抗体检测试剂盒检测羊痘疫苗免疫牛血清抗体水平

目前国内尚无商品化的牛结节性皮肤病疫苗,对于该病的防控,我国采用羊痘疫苗进行紧急免疫。为了验证牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒对羊痘疫苗免疫血清抗体水平检测的适用性,本研究采用实验室试制的牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒和病毒中和试验对羊痘病毒活疫苗免疫血清、在研牛结节性皮肤病灭活疫苗(山羊痘AV41株)免疫血清进行抗体水平评价。结果显示,对于羊痘活疫苗免疫血清,ELISA方法和病毒中和试验方法对免疫15d抗体阳性率分别为84.4%和75.6%,免疫30d抗体阳性率分别为100%和95.6%,免疫60d抗体阳性率分别为97.8%和91.1%;与病毒中和试验符合率为86.1%。对于牛结节性皮肤病灭活疫苗(山羊痘AV41株)免疫血清,ELISA方法和病毒中和试验方法对一免28d抗体阳性率分别为64%和56%,二免28d抗体阳性率分别为94%和88%,二免42d阳性率均为100%;与病毒中和试验符合率为86.5%。试验证明,实验室试制的牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒与病毒中和试验符合率较高,检测结果较为一致,且本试剂盒敏感性高于病毒中和试验。因此本试剂盒可用于牛结节性皮肤病抗体水平检测。

血站血液检测实验室ELISA项目性能验证试验建立与探讨

目的验证血站实验室的酶联免疫吸附方法检测项目的性能。方法在实验室检测系统中验证ELISA项目的重复性、精密度、灵敏度、特异性、符合性、检出限以及抗干扰性。结果检测系统的重复性为100%;各系统批内不精密度均<10%,批间不精密度均<15%;灵敏度、特异性及符合率为100%,2种试剂的检出限分别为0.75 NCU/mL和0.25 NCU/mL;抗干扰性符合试剂说明书要求。结论对ELISA检测项目进行性能验证数据的分析对比,有助于不断改进和提高检测系统性能,保证临床用血安全。

2种猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA检测试剂盒的比较分析

选取2种猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA检测试剂盒进行符合率、敏感性(D_(se))、特异性(D_(sp))、批内重复性(Re)比较分析,以期了解国产试剂盒与进口试剂盒在试验结果上的差异性。结果显示:通过对45份临床样品进行检测发现金诺试剂盒检测敏感性(D_(se))为84%,检测特异性(D_(sp))为100%,2种试剂盒总符合率为91.11%。该研究结果为实验室检测猪繁殖与呼吸综合征抗体提供了试剂盒选用参考。