重组黄瓜花叶病毒2b基因PVX侵染性载体的稳定性分析

本研究利用北京甘蓝CMV分离物(CMV-BG)全长2b基因,构建了含其正义和反义序列的PVX侵染性载体pVX2bS和pVX2bAS,并进行了它们与PVX侵染性载体间的共侵染稳定性实验。结果表明:pVX2bS和pVX2bAS能侵染本氏烟、SR1、Sam sun NN烟草、Shepody马铃薯和中蔬5号番茄,与pSfinx相比,表现不同程度的症状延迟效应;pVX2bS和pVX2bAS在22℃/16℃(昼/夜温度)条件下,接种SR1烟草45d仍可检测到重组载体的存在;pVX2bS和pVX2bAS菌液混合接种15d后只能检测到正义或反义一种载体的随机表达,二者交互接种,后接种的一方不能表达。

利用病毒载体在烟草中瞬时表达融合HBsAg基因

利用马铃薯PVX病毒载体构建了外源人工融合乙肝表面抗原HBsAg基因的表达载体,在烟草中利用农杆菌介导进行瞬时表达,以快速鉴定外源基因瞬时表达的状况以及重组蛋白的免疫活性。利用PCR技术从含有人工融合HBsAg基因的表达载体中分别扩增出LP+PreS1+PreS2+S、PreS1+PreS2+S、PreS2+S序列,将其分别与PVX病毒载体pgR106连接,构建成PVX-LP、PVX-S1和PVX-S2等3个转化载体,并将此载体导入农杆菌菌株GV3101中用于侵染烟草植株叶片。感染植株经RT-PCR、RNA Dot blotting和HBsAg蛋白的ELISA检测显示,3个人工融合的HBsAg基因均可在植物体内得到转录,翻译成具有活性的蛋白。结果表明,外源融合HB-sAg基因经过植物病毒载体瞬时表达系统可以在植物系统中正常转录和翻译。

木尔坦棉花曲叶病毒V2蛋白N端保守脯氨酸对病毒致病性的影响

木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMuV)是棉花曲叶病的主要病原之一,其V2蛋白在病毒致病过程中起重要作用。本研究对V2蛋白N端第4位脯氨酸在病毒致病过程中的作用进行了分析。通过构建马铃薯X病毒(PVX)异源表达载体(PVX-V2、PVX-V2^(P4A)),利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现,PVX-V2能够增强PVX异源病毒的致病性,致使PVX在植物体内复制量增加,而PVX-V2^(P4A)对PVX异源病毒致病性的影响相对较小。通过构建V2基因突变体(ΔV2、V2^(P4A))侵染性克隆,利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现,ΔV2、V2^(P4A)侵染性克隆引起的症状较野生型更弱。结果表明,CLCuMuV V2蛋白N端第4位脯氨酸在病毒侵染过程中起重要作用。

拟南芥Flowering Locus T基因生物功能及其mRNA移动能力研究

【目的】研究拟南芥FT(Flowering Locus T)基因在拟南芥植物开花过程中的重要作用及其mRNA的长距离运移能力。【方法】将FT基因功能序列及其突变序列mFT(起始密码子突变为终止密码子)连接入马铃薯X病毒(Potato Virus X,PVX)载体和去除外壳蛋白(Coat Protein,CP)序列的芜菁缩叶病毒(Turnip crinkle virustruncated coat protein,TCV△CP)载体中,经体外反转录得到病毒目的片段RNA,然后分别用PVX-FT侵染烟草,TCV△CP-FT侵染拟南芥。【结果】人工接种PVX-FT可以诱导烟草开花;TCV△CP-FT和TCV△CP-mFT人工侵染拟南芥叶片后,经RT-PCR检测发现,在侵染的叶片中与其上部新生叶片中有TCV△CP-FT和TCV△CP-mFT序列,表明FTmRNA序列可以帮助失去细胞间移动能力的TCV△CP恢复移动能力,并且在顶芽中检测出明显条带,经测序证实为FT基因序列。【结论】FT可以诱导短日照品种烟草在长日照条件下开花,而且FTmRNA功能序列可以协助因失去CP序列而没有细胞间移动能力的TCV△CP恢复移动能力。

重组马铃薯X病毒注射番茄果实高效表达胸腺素α1

植物病毒载体表达外源蛋白表达水平高、表达速度快、宿主范围广。本研究用马铃薯X病毒(PVX)载体在番茄果实中表达胸腺素α1(Tα1),是一种快速高效生产医用蛋白的新方法。将pGEM-T-Easy-Tα1质粒酶切,获得大约100bp大小的Tα1基因片段,并将该片段与PVX载体(pGR-107)连接,用SalI和ClaI酶切鉴定,筛选出阳性重组体。进一步将重组质粒转化根癌农杆菌GV3101,用农杆菌注射法(Agroinjection)侵染不同生长阶段的番茄果实,用ELISA检测外源蛋白Tα1的表达水平。结果表明已成功构建了pGR107-Tα1表达载体,在农杆菌的菌液密度(OD600值)为1.0、番茄植株开花后2周半到3周时侵染番茄果实,Tα1的表达量最大。

棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

采用功能筛选策略从以PVX病毒载体建立的棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)cDNA文库中克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段).以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA文库,采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana),从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆.对上述阳性克隆进行序列测定和分析,结果显示,其中7个与已知的基因具有较高的同源性,其中PBC43编码一个特异的elicitin蛋白;PBC163编码一个Rab蛋白,与大豆疫霉的RAB同源性较高;PBC241编码抗增殖蛋白(prohibitin);PBN62编码一个热激蛋白60(HSP60).还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因,提示可能是该病原菌特异的激发子基因.上述结果表明,利用病毒表达载体构建cDNA文库,用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生过敏反应的激发子基因,该方法可望为其他植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台.