青岛及周边地区马铃薯Y病毒株系类型分析

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是目前马铃薯生产中的重要病毒,PVY侵染马铃薯会造成产量、质量的严重下降。为了探明青岛及周边地区PVY株系类型,本次共采集青岛及周边地区485份马铃薯疑似PVY样本,共检测出298份PVY阳性样本。对PVY样本进行RT-PCR扩增,结果显示:本地区的主要株系为PVY^(NTN-NW)(SYR-Ⅱ型),占比为62.4%;PVY^(N-Wi)株系占比为31.6%;复合侵染株系占比为6.0%。对复合侵染株系的单株块茎(编号ShouGuang)进行测序、BLSAT比对及Simplot和RDP软件分析,显示PVY复合侵染的马铃薯植株体内存在两种重组类型(ShouGuang-Y1和ShouGuang-Y2);发生重组的位点主要集中在P1-1、HC-Pro/P3、6K2/VPg 3个区域。通过对PVY的不同变异株系分析,可为PVY株系的遗传多样性提供理论基础,为青岛及周边地区PVY防控提供理论依据。

接种PVY^N后烟草叶片SOD活性和MDA含量变化研究

对接种马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系后烟草叶片内超氧化物岐化酶活性及其同工酶谱带和丙二醛含量进行了分析。结果表明，接种ＰＶＹＮ后烟草叶片内超氧化物岐化酶活性发生明显变化，接种后１４ｄ内其活性值均较对照增高，其中接种后第８ｄ达高峰值，约比对照增加７２．３％，１４ｄ后超氧化物岐化酶活性开始下降，至接种后１６ｄ约低于对照２８．０％。接种后ＳＯＤ同工酶谱带与对照相比差别不大，仅在接种后第８ｄ出现了一条新带。接种后烟草叶片内丙二醛含量逐渐增加。

转马铃薯Y病毒复制酶基因烟草的获得及抗病性分析

重组克隆ＤＮＡ用ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ双酶切得到马铃薯Ｙ病毒ＮＩｂ基因，将其插入质粒ｐＲＯＫ２相应切点中构成植物表达载体。用重组质粒ｐＲＯＫ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａ－ｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，叶盘法将ＮＩｂ基因转入烤烟品种ＮＣ８９的染色体，获得抗卡那霉素的转化再生植株。经抗性筛选、ＰＣＲ检测、无性扩繁和大量重复抗病鉴定，结果表明，转化烟草植株ＤＮＡ中整合了外源目的基因，且表现抵抗２０μｇ／ｍｌＰＶＹＮ的侵染，ＥＬＩＳＡ分析认为抗性植株无病毒累积，初步筛选出对ＰＶＹＮ侵染具有较高抗性的转基因烟草植株。

铜元素诱导烟草抗PVY^N相关生理生化及信号物质的研究

通过气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)及生理生化指标的测定,研究了铜(Cu)元素诱导感染PVYN的烟株信号物质的积累及对系统抗性的影响。结果表明:喷施Cu元素能延迟烟株显症和叶脉出现褐色坏死时间,降低发病程度,病毒增殖受到抑制,烟株体内的与抗性相关物质如脯氨酸及可溶性糖含量升高,电解质的外渗减少。此外,Cu元素处理能诱导信号物质水杨酸和乙烯的积累,水杨酸含量在接种后15d达到最大量3.93μg·g-1,为接种对照的1.3倍;而乙烯释放量在3～9d内均高于接种对照,在12d时乙烯释放量显著低于接种对照,分析认为前期Cu元素处理后诱导了乙烯释放的增强,进行抗性信号的传递。因此,喷施Cu元素后可以诱导烟草植株产生抗病性,增强烟草对PVYN侵染的抵抗力,并且诱导了相关抗性信号的传递。

抗PVY^N药剂-KY1号的研制及其作用机理的研究

本文对自主开发的抗 PVYN药剂—KY1号的防治效果及其作用机理做了初步探讨。室内试验表明 ,KY1号对烟草 PVYN的防治效果高达 88.34% ;大田试验表明喷施 KY1号对烟草 PVYN的防治效果为 84 .8% ,明显优于目前常用农药病毒 A、菌克毒克等。对 KY1号抗病毒的作用机理进行了研究。结果表明 KY1号对 PVYN有强烈的体外钝化作用 ,且钝化作用是不可逆的。KY1号体外能将病毒粒子破坏成小碎段 ,使其失去侵染能力 ;对 POD活性的研究表明 ,KY1号的处理酶活性普遍提高 ,明显高于对照 ,且高峰期延后 2～ 3d,与症状发展一致。POD同工酶谱带分析表明 KY1号处理出现对照没有的一条新谱带 ;KY1号还能抑制烟草赤星病菌。

铁元素诱导烟草抗PVY^N的调控作用研究

采用病情指数调查、DAS-ELISA和生理生化指标测定的方法,研究了铁元素对烟草抗马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)的室内效果及对植株抗病性的诱导作用。结果表明:当烟草叶面喷施铁元素浓度为33.60 mg·L-1时,烟株显症时间要迟于对照,使病毒含量降低至7.31mg·mL-1,仅为对照的45%。单独喷施铁元素和喷施铁元素后再接种PVYN处理,均能提高烟株体内过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO)活性,并且在短时间内使活性氧的生成速率提高1.6倍,叶绿素a的含量提高1.4倍,表明铁元素能诱导烟株防御反应的应答,但对苯丙氨酸解氨酶(PAL)影响不大。此外,铁元素处理后再接种PVYN的烟株体内PPO活性一直呈缓慢上升趋势,在12d内略高于接种对照烟株,而12d后为显症时期,接种对照烟株体内的PPO活性迅速上升为6463.54U.mg-1pro·h-1,是铁元素处理后接种烟株的1.5倍,表明PPO与叶脉褐变密切相关,而铁元素处理可以抑制PPO活性的快速提高,从而减轻褐变症状。因此,喷施铁元素后可以诱导烟草植株产生抗病性,增强烟草对PVYN侵染的抵抗力。

马铃薯Y病毒N株HC-pro基因的序列分析与表达

马铃薯Ｙ病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯Ｙ病毒属(Potyvirus)的典型成员,是烟草、马铃薯和辣椒等茄科作物病毒病的主要病原之一,分布于世界各地.近年烟草上的 PVY在全国范围内特别是陕西、黄淮和东北烟区流行呈上升趋势,且以PVY坏死株系（PVY-N)为主,重病田发生率达40%以上,并常与烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒混合侵染,严重影响烟草品质造成巨大的经济损失.

马铃薯Y病毒脉坏株系(PVY^N)的侵染对烟草光合作用和呼吸作用的影响

感染马铃薯Y病毒脉坏死株系后，烟草叶片的叶绿素含量和Hill反应活性均明显降低，光合速率在接种后2天出现增高现象，随后逐渐降低，呼吸速在接种的后2～6天明显降低，显症初期呼吸速率增高，随后大幅度降低．

转基因烟草感染马铃薯Y病毒脉坏死株系后某些酶活性变化的比较研究

烟草感染马铃薯Y病毒脉坏死株系后，过氧化物酶活性升高，但非转基因敏感烟草升高的幅度大于转基因抗病烟草；同时，非转基固敏感烟草的苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性均增高，并且都出现两个活性高峰，但转基因抗病烟草的苯丙氨酸解氨酶活性仅出现第一个活性高峰，随后其活性值降低并逐渐恢复至未接种时的水平，而多酚氧化酶活性则降低；在未感染PVYN的情况下，转基因抗病烟草的过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性均比非转基因敏感烟草高．

抗PVY^N烟草突变株SN01的筛选及其生理生化特性

为筛选出烟草抗PVYN种质资源,利用病毒汁液摩擦接种法,从烤烟品种NC89烟株中筛选出一株自然突变的抗PVYN变异株,留取其种子编号为SN01。接种PVYN后,对抗病植株SN01与常规NC89烟株的总酚、类黄酮、丙二醛含量以及多酚氧化酶(PPO)活性进行了比较。结果表明:在接种后第12 d烟草抗PVYN突变株SN01的总酚和类黄酮含量最高,高于常规NC89,丙二醛含量基本无变化,PPO活性在接种后第15 d有小幅度升高,但明显低于接种后常规NC89的PPO活性,说明在接种PVYN后抗病突变株与常规NC89烟株的生理指标有明显差异,抗病突变株对病毒的侵染有较强的抵抗和调节能力。

烟草抗PVY^N突变株eIF4E基因的克隆及表达差异分析

为了明确抗马铃薯Y病毒病的相关基因、进一步揭示其抗病机制,以烟草高抗马铃薯Y病毒脉坏死株系(Potato virus Y vein necrosis strain,PVYN)突变株SN01和SN02为试验材料,研究了突变株的抗病相关基因翻译起始因子4E(e IF4E)在寄主中的抗病作用。结果表明:从抗病突变株SN01和SN02中克隆到目的全长基因,分别命名为e IF4E01与e IF4E02,其开放阅读框ORF长度均为669 bp,编码222个氨基酸;利用MAGA4.1和CLUSTAL软件进行序列同源性比对分析表明,e IF4E01和e IF4E02与已报道的烟草e IF4E(Gen Bank:AY702653.1)基因序列相似度均达到99%,其开放阅读框序列完全一致。并与甜椒、番茄、拟南芥等物种的e IF4E家族基因也具有高度同源性;Real-time PCR结果表明,在PVYN侵染初期(接种后0~9 d),突变株SN01和SN02中的e IF4E基因表达量明显低于其感病亲本NC89和K326。说明这两个抗病突变株中的e IF4E基因的抑制表达与烟草对PVYN的抗性密切相关。

应用酶联免疫吸附试验法鉴定几种主要马铃薯病毒

制备了PVX,PVY_o,PVY^n,PVA,PVS,PVM,PLRV和TRV等8种主要马铃薯病毒抗体的辣根过氧化物酶结合物,在检测黑龙江省马铃薯主栽品种克新一、二、三、四号等品种的植株样品1155份和800余份正在脱毒中的试管苗样品中,发现上述8种马铃薯病毒在几个主栽品种中的侵染率较高,而且大多数感病植株是由3至7种病毒复合侵染,并首次查明本省存在PVY^n和PVM病毒。对不带上述8种病毒的样品又用双向反向聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定带马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle Tuber Viroid)状况,现已获得无上述8种病毒和类病毒的种植材料。

铜元素诱导烟草抗马铃薯Y病毒脉坏死株系机理研究

采用病情指数调查、DAS-ELISA和生理生化指标测定的方法,研究了铜(Cu)元素对烟草抗马铃薯Y病毒脉坏死株系(Potatovirus Y-vein necrosis strain,PVYN)的室内效果及对植株抗病性的诱导作用。结果表明:喷施不同浓度的铜元素均能延迟烟株显症和叶脉出现褐色坏死时间,降低发病程度,烟株体内病毒含量也明显减少,当Cu元素浓度为0.8mg/L时,效果最显著。单独喷施Cu元素(0.8mg/L)和喷施Cu元素后再接种PVYN的处理,均能提高烟株体内叶绿素a、叶绿素b含量及苯丙氨酸解氨酶活性;另外,单独喷施Cu元素处理烟株后能诱导总酚和类黄酮含量的提高,但喷施Cu元素后接种PVYN的烟株中总酚和类黄酮的含量在接种处理后3d内迅速上升高于对照,随后下降,在6d后虽又呈缓慢上升趋势,但仍明显低于对照。总酚和类黄酮的含量与叶脉褐变密切相关,因此总酚和类黄酮含量的降低可减轻植株褐变。研究表明,Cu元素具有诱导抗病性、增强烟草对PVYN侵染的抵抗能力。

hpRNA的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响

以马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因3′端50bp片段为hpRNA的茎,以pUC19不同长度的序列为hpRNA的环,构建了茎环比例分别为4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4和1∶8的植物表达载体。利用农杆菌介导法转化烟草品种NC89,获得了多种转基因植株。室内抗病性检测发现:不同茎环比例的hpRNA介导的病毒抗性效率不同;茎环比例为4∶1、2∶1和1∶1时效率较高,抗性植株的比例达60%左右;随着环长度的逐渐增加,抗性植株的比例逐渐降低;当茎环比例为1∶8时,抗性植株的比例仅为9.52%。Southern blot分析结果表明:外源基因已整合于烟草的基因组中,且转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性。Northern blot分析结果表明:目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的。