河南省结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA分析

目的了解河南地区结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺（PZA）分离株pncA基因突变情况，探讨与耐PZA之间的关系。方法对41例结核分枝杆菌临床分离株进行常规培养和药敏检测，采用聚合酶链反应-测序技术检测pncA基因的突变。结果有68．29％（28／41）的耐药菌株PncA发生突变从而改变了吡嗪酰胺酶氨基酸序列的一级结构。28株临床分离突变株涵盖碱基替代、插入突变和缺失突变等类型。突变分布在pncA基因整个序列，位于开读框架的3～535位的核苷酸。结论河南地区结核分枝杆菌耐PZA主要机制之一为pncA基因突变。

结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药相关蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段;通过pET28a构建表达载体pET28a-pncA,序列测定证实正确后转化大肠埃希菌DH10b,经IPTG诱导表达His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白。结果扩增出结核分枝杆菌pncA基因并构建了具有正确基因序列的质粒载体pET28a-pncA,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了分子质量单位约20ku的表达产物,并得到纯化的带His标签的目的蛋白。结论构建了结核分枝杆菌pncA基因原核表达质粒,并诱导表达了His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。

结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶-GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX4T-1构建表达载体pGEX4T-pncA,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH10b,再经IPTG诱导表达谷胱甘肽S转移酶(GST)-吡嗪酰胺酶融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌pncA基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-pncA,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。