淡紫拟青霉M-1固体发酵工艺优化及基于自动化种曲机的中试生产

淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus在线虫生物防治上表现出巨大的潜力,但大规模生产技术的不成熟以及产品货架期短限制其工业化生产。为获得淡紫拟青霉M-1固体发酵的最佳条件,并建立其规模化生产工艺,本研究采用单因素和正交试验对淡紫拟青霉M-1固体发酵培养的组成、发酵条件以及烘干条件进行了优化,结果表明淡紫拟青霉M-1固体发酵最佳的培养基组成为麸皮:玉米粉为1:1、蔗糖添加量5%、尿素添加量0.1%、硫酸铵添加量0.1%、料水比1:0.67,固体发酵最佳的培养条件为培养温度28℃、培养时间为7 d、液体接种量为5%、固体接种量为0.5%,固体菌剂最适烘干条件为在35℃烘干24h,在此条件下淡紫拟青霉M-1固体菌剂的有效活菌数为9.47×10^9CFU/g。在此基础上,基于自动化种曲机,建立淡紫拟青霉M-1规模化固体发酵工艺,并通过3个批次规模化生产进行验证,获得将近2 t淡紫拟青霉M-1固体菌剂产品,菌剂有效活菌数能达到15.6×10^9 CFU/g,杂菌率极低(<0.01%),水分含量为9.68%。由此说明,该工艺可用于淡紫拟青霉M-1工业化生产,且产品质量优异。

深海来源淡紫拟青霉ZBY-1的代谢产物及其抗肿瘤活性

目的阐明来自深海海水的淡紫拟青霉ZBY-1的代谢产物及其抗肿瘤活性。方法采用活性跟踪分离模式,利用各种色谱技术分离纯化代谢产物;根据理化和波谱数据结合部分化合物的甲醇解反应鉴定化合物结构;采用MTT法测试抗肿瘤活性。结果从淡紫拟青霉ZBY-1发酵产物中分离鉴定了9(11)-去氢过氧化麦角甾醇(1)、过氧化麦角甾醇(2)、(22E,24R)-5α,6α-环氧-3β-羟基麦角甾-22-烯-7-酮(3)和脑苷脂A(4)、B(5)、C(6)、D(7)等7个化合物。化合物1～3对人癌细胞K562、MCF-7、HL-60、BGC-823有较强抑制作用,IC50在9.5～59.6 mg/L之间,而4～7对上述4种癌细胞均无抑制活性。结论本文是有关深海来源淡紫拟青霉代谢产物的首篇研究报道。化合物1～7为首次从淡紫拟青霉产物中分离得到,其中1和3首次从拟青霉属、3还首次从真菌中分离报道。化合物1对K562和BGC-823细胞以及3对上述4种癌细胞的抑制活性亦属首次测试报道。

淡紫拟青霉ZBY-1的次级代谢产物及其抗肿瘤活性

目的阐明来自深海海水的淡紫拟青霉ZBY-1的代谢产物及其抗肿瘤活性。方法采用活性跟踪模式分得活性组分，利用各种色谱技术分离纯化代谢产物。根据理化和波谱数据鉴定化合物结构。采用MTF法测试抗肿瘤活性。结果从淡紫拟青霉ZBY．1发酵产物中分离鉴定了paecilaminol（1）、paecilaminol盐酸盐（2）、1（2）-linolyl-2（1）-palmityl—glycero—04’-（N，N，N．trimethyl）homoserine（3）、1，2-dilinolylglycero—O-4’-（N，N，N—tfimethyl）homoserine（4）、肉豆蔻酸甲酯（5）、亚油酸甲酯（6）、亚油酸（7）、油酸（8）、3-吲哚甲醛（9）、3一吲哚甲酸（10）和对羟基苯甲酸（11）等11个化合物。化合物1和2对4种人癌细胞有较强的抑制作用，IC50值为1．12～8．63μmol／L，且2对该4种人癌细胞的抑制活性是1的2．2—2．7倍。结论化合物1—11为首次从淡紫拟青霉产物中分离得到，其中3、4和9—11还系首次从拟青霉属分离报道。化合物1是菌株ZBY-1的主要抗肿瘤活性产物。本文首次报道1和2对人癌细胞的抑制活性。

红树林真菌PH0016胞外多糖对单纯疱疹病毒Ⅰ型活性的影响

目的探讨真菌菌株PH0016的胞外多糖(EPS)抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)的活性及机制。方法对分离自海南红树林的一株真菌菌株行菌株鉴定和ITS序列分析;对其产生的EPS行体外、体内细胞毒性实验和抗HSV-1作用观察。结果菌株初步鉴定为淡紫色拟青霉菌。EPS可抑制HSV-1病毒活性,其对HSV-1感染细胞病变的半抑制浓度(IC50)为195μg/mL,SI为11.45。EPS可明显提高小鼠HSV-1感染小鼠的存活率及存活时间。结论自海南红树林中分离一株真菌菌株PH0016,属淡紫色拟青霉菌;其产生的胞外多糖具有抗HSV-1活性,值得进一步研究。

海南红树林淡紫拟青霉EPS纯化物体外抗HSV-1实验研究

目的:探讨海南红树林淡紫拟青霉胞外多糖(EPS)纯化物体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)活性,为开发新型抗病毒药物提供基础研究。方法:以Vero细胞为病毒感染靶细胞,以不同浓度EPS纯化物作用于HSV-1感染过程的各个阶段,以细胞病变程度(CPE)测定病毒半数感染量(TCID5 0),MTT法检测该纯化物对Vero细胞的毒性作用及对HSV-1的直接灭活作用、对病毒吸附和生物合成的影响。结果:EPS纯化物对Vero细胞无增殖作用,其半数有毒浓度(CC5 0)为735.49μg/mL,纯化物在400μg/mL以下时,细胞存活率达90%以上;在所用浓度范围内该纯化物可不同程度抑制病毒吸附,抑制率最高达35.0%,与病毒对照组相比差异具有显著性(P<0.01);该纯化物还具有抑制HSV-1生物合成作用,抑制率与药物浓度呈现出量效关系,其半数抑制浓度(IC5 0)为387.26μg/mL,最高抑制率达61.3%;在所用浓度范围内未发现该纯化物对HSV-1有直接灭活作用。结论:红树林来源的淡紫拟青霉EPS纯化物对Vero细胞毒性较小;该纯化物在一定浓度范围内可抑制HSV-1吸附和生物合成,且抑制生物合成作用较强,并表现出一定量效关系。

海南红树林淡紫拟青霉胞外多糖抗HSV-1作用研究

目的探讨红树林淡紫拟青霉胞外多糖体内抗单纯疱疹病毒-1(HSV-1)作用。方法选取昆明种小鼠75只,随机分为正常对照组,病毒对照组,低、中、高剂量组,每组15只。正常对照组给予DMEM 0.5 ml腹腔注射,其余4组给予HSV-10.5 ml腹腔注射。次日低、中、高剂量组小鼠分别经腹腔注射淡紫拟青霉胞外多糖6、8、10 g/(kg·d);正常对照组和病毒对照组腹腔注射生理盐水0.5 ml,连续注射7 d。观察并比较各组小鼠肝脏病理变化;5组小鼠脑组织匀浆上清液接种于Vero细胞,观察其细胞病变情况;提取同一部位脑组织病毒基因组DNA,检测病毒DNA相对含量及血清干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。结果与正常对照组比较,病毒对照组和低剂量组小鼠肝脏汇管区大量炎性细胞浸润,部分肝细胞肿胀;中剂量和高剂量组炎性细胞浸润明显减少。与病毒对照组相比,中、高剂量组脑组织HSV-1病毒DNA相对含量减低(P<0.01),低剂量组病毒DNA相对含量与病毒对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,其余4组小鼠血清IFN-γ、IL-12、TNF-α水平均显著升高(P<0.01);高剂量组IFN-γ水平高于病毒对照组和低、中剂量组(P<0.01);中、高剂量组IL-12水平高于病毒对照组和低剂量组(P<0.01)。与病毒对照组比较,低、中、高剂量组TNF-α水平均显著降低,且中、高剂量组低于低剂量组(P<0.01)。结论红树林淡紫拟青霉胞外多糖具有一定抗HSV-1作用,可能是通过抑制病毒复制、刺激IFN-γ和IL-12分泌,抑制TNF-α产生完成的。

淡紫拟青霉在大棚蔬菜育苗基质中的动态变化

将淡紫拟青霉不同菌株稀释后处理土壤后播种黄瓜,研究不同生长天数的黄瓜苗根际土壤中菌株的生长情况,明确不同菌株在育苗基质中的动态变化,并筛选出适宜的土壤添加浓度。结果表明:不同淡紫拟青霉菌株的生长速度不同,且不同添加浓度菌株的生长趋势也不很一致,其中IPC-P菌株生长速度最快,菌落数明显多于其它2个菌株;IPC-P菌株添加到土壤中的适宜浓度为1×104个/mL;XCZ 1-3菌株添加到土壤中的适宜浓度为1×105个/mL;YES菌株添加到土壤中的适宜浓度为1×105个/mL。

红树林淡紫拟青霉EPS提取物体外抗HSV-1机制研究

目的探讨红树林淡紫拟青霉胞外多糖(extracellular polysaccharides,EPS)提取物体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)感染的机制。方法以Vero细胞为病毒感染靶细胞,以不同浓度EPS提取物作用于HSV-1感染过程的各个阶段,MTT法测定提取物对Vero细胞的毒性作用和对HSV-1的直接灭活作用及对病毒吸附和生物合成的影响;采用RT-PCR检测该提取物对病毒gD基因US6和DNA聚合酶基因UL30表达的影响。结果 EPS提取物对Vero细胞无促进增殖作用,其对Vero细胞的半数有毒浓度(CC50)为1 300.17μg/ml,浓度在800μg/ml以下时细胞存活率达90%以上;在25~800μg/ml浓度范围内该提取物可抑制HSV-1吸附和生物合成,并表现出一定量效关系;浓度为800μg/ml时抑制率最高,分别为39.5%和59.7%,与病毒对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),但并不能达到完全抑制。未发现该提取物对HSV-1有直接灭活作用。RT-PCR显示该提取物可干扰病毒US6和UL30基因转录,灰度扫描分析US6mRNA丰度与病毒对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);UL30mRNA丰度与病毒对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论 EPS提取物对Vero细胞毒性较小,使用安全。该提取物具有一定的抗病毒作用,可抑制HSV-1吸附和生物合成,还可抑制US6和UL30基因转录。

红树林淡紫拟青霉EPS对HSV-1颅内感染小鼠脑组织NF-κB表达的影响

目的探讨红树林淡紫拟青霉胞外多糖(EPS)对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)颅内感染小鼠脑组织核因子κB(NF-κB)表达的影响。方法除阴性对照组外,其他各组小鼠均颅内注射病毒建立HSV-1颅内感染模型,次日起实验组分别经腹腔给予低剂量、中剂量和高剂量EPS干预,药物对照组用阿昔洛韦干预,病毒对照组和阴性对照组均用生理盐水干预,连续注射7 d。观察各组小鼠病变、死亡情况,免疫组织化学检测脑组织NF-κB表达情况,RT-qPCR检测脑组织NF-κB mRNA表达。结果除病毒对照组小鼠死亡率明显高于阴性对照组(P<0.05)外,其他各组间无明显差异(P>0.05)。免疫组织化学和RT-qPCR检测均发现,与病毒对照组相比,实验组小鼠脑组织NF-κB表达均有一定程度下调,其中高剂量EPS组下调最明显(P<0.05),低剂量、中剂量EPS组下调不明显(P>0.05)。低剂量、中剂量EPS组NF-κB表达与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),高剂量EPS组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论红树林淡紫拟青霉EPS具有一定抑制HSV-1颅内感染小鼠脑组织NF-κB表达的作用,且该抑制作用呈一定剂量依赖性。