黄牡丹花粉生活力测定方法的比较研究

以黄牡丹的新鲜花粉为试材,利用单因子试验比较了液体培养基中蔗糖浓度、硼、钙、镁、钾对黄牡丹花粉萌发的影响,在此基础上进行了正交试验,比较了蔗糖、H3BO3及CaCl2对黄牡丹花粉萌发的影响;通过对醋酸洋红染色法、I-KI染色法和TTC染色法的比较,寻找快速测定黄牡丹花粉生活力的方法。试验结果表明:蔗糖及H3BO3对黄牡丹花粉萌发有极显著影响。在pH值为6.0时,蔗糖150 g.L-1+H3BO330 mg.L-1+CaCl220 mg.L-1适宜黄牡丹花粉培养,萌发率为68.7%;纯水培养没有造成花粉原生质体破裂,内含物外流,但萌发率极低,仅为3%;200 g.L-1以上的高浓度蔗糖溶液和300 mg.L-1以上的高浓度盐溶液会造成原生质体失水萎缩,质壁分离,这两种情况都抑制花粉萌发;TTC染色法测得的花粉活力率为64.9%,是快速测定黄牡丹花粉生活力的最适染色法。

黄牡丹与芍药组间杂交花粉与柱头识别的解剖学研究

分别用TTC染色法和培养液培养法测定黄牡丹花粉的生活力和萌发率;并分别以5个芍药品种为母本,黄牡丹为父本进行人工杂交,用苯胺蓝染色法,在荧光显微镜下观察黄牡丹花粉在母本(‘墨玉双辉’、‘奇花露霜’、‘手扶银须’、‘金凤’和‘美菊’)柱头上的黏附、萌发以及花粉管在柱头和花柱中的动态变化。结果显示:(1)黄牡丹离体花粉生活力达64.9%、萌发率达68.7%。(2)授粉后24h,黄牡丹花粉在‘奇花露霜’、‘手扶银须’和‘金凤’柱头上的黏附数最多分别为134.5、80.9和100.5个,萌发花粉数也达到最多,分别为46.3、69.7和86.6,说明花粉与母本柱头的黏附性较好。(3)授粉后黄牡丹花粉黏附在柱头处及其附近的柱头乳突细胞内产生大量胼胝质;花粉管生长迟缓,且有扭曲、肿胀、结合、分枝等现象发生;少数花粉管能穿过柱头进入花柱,但常有胼胝质沉积其中。从黄牡丹花粉与5个芍药品种柱头的识别作用来看,受精前障碍是影响黄牡丹与芍药组间杂交的主要原因之一。

黄牡丹花粉萌发特性的研究

对黄牡丹的花粉萌发条件的研究结果表明:4个黄牡丹居群花粉萌发所需pH值表现出两水平分化;而对硼酸质量浓度的要求则差异不大,为0 07～0 08g·L-1;4居群花粉萌发所需蔗糖质量浓度的差异较大,表现出蔗糖质量浓度高低与黄牡丹垂直分布呈正相关,高海拔分布的居群其花粉悬液萌发所需的蔗糖质量浓度达140 00g·L-1。研究还表明在干燥低温(2℃左右)条件下,黄牡丹花粉存活时间约为140d,较其变异类型存活时间长,但其花粉萌发力则弱于其变异类型。

^(60)Co-γ射线辐照对黄牡丹种子萌发及幼苗生长的影响

对黄牡丹种子进行不同剂量的60Co-γ射线辐照处理,以未照射种子为对照,观测辐照对种子生根、萌发及幼苗生长的影响。结果表明:种子生根率和萌发率随辐照剂量增加而降低,高剂量(100 Gy以上)对种子萌发和幼苗生长有显著的抑制作用(P<0.05),辐照的剂量与幼苗存活率呈负相关,且幼苗表型性状各不相同。根据试验数据以及回归分析确定黄牡丹种子的临界剂量为48.5 Gy,适宜剂量范围为40～60 Gy。

云南野生黄牡丹PlbHLH3转录因子基因的克隆与表达

以云南野生黄牡丹为试材，基于已构建的花瓣转录组数据库，筛选到了24个与花色素苷合成相关的bHLH转录因子蛋白同源性高的Unigene序列，命名为HbHLH1～24。通过开放阅读框（ORF）的氨基酸序列比较和系统进化树分析，发现plbHLH3可能参与调控花色素苷合成，其ORF包含一个2040bp的开放阅读框，编码一个679个氨基酸的蛋白；其氨基酸序列与葡萄VvMYCl和苹果MdbHLH3的亲缘关系最近，相似性达60％以上。相对荧光定量PCR分析表明，plbHLH3在黄牡丹和紫牡丹的不同组织中均有表达，在两者的花药，心皮和花瓣中的表达显著高于在萼片和叶片中的表达；plbHLH3在紫牡丹的硬蕾期高丰度表达，而在黄牡丹的硬蕾期表达量最低，在其他4个时期的表达量显著或极显著高于在硬蕾期的表达量。本研究推测PlbHLH3参与黄牡丹花色素苷合成的调控作用，为今后深入探讨黄牡丹花色形成机制奠定理论基础。

黄牡丹研究现状与展望

系统总结了我国珍稀资源黄牡丹的研究现状,概括分析了其染色体核型与系统分类地位、在栽培品种起源中的作用以及亲缘关系、生理特性与育种应用等多方面的研究成果。最后指出了当前研究仍然存在的主要问题,并对未来发展方向提出几点建议。

黄牡丹PlWDR3和PlWDR18转录因子基因的克隆与表达

以云南野生黄牡丹为试验材料,根据已构建的云南野生黄牡丹花瓣转录组数据库提供的WDR40蛋白的Unigene筛选得到19个与花色素合成相关的WDR40蛋白同源性高的Unigene序列,命名为PlWDR1~19.通过氨基酸序列比较和系统进化树分析,发现PlWDR3和PlWDR18可能参与调控黄牡丹的花色素合成。PlWDR3的ORF包含1个1 032bp的开放阅读框,编码1个344个氨基酸的蛋白,与苹果MdTTG1的亲缘关系最近,相似性达83.29%;PlWDR18的ORF包含1个1 035bp的开放阅读框,编码1个345个氨基酸的蛋白,与葡萄VvWDR2相似性最高,达93.77%。相对荧光定量PCR分析表明,PlWDR3在黄牡丹和紫牡丹的不同时期的表达模式基本相似,在黄牡丹和紫牡丹圆桃期表达量最高,在初开期表达量最低;PlWDR18在黄牡丹花发育初期呈上升趋势,在透色期达到最高峰,然后下降,在初开期达到最小值;在紫牡丹花发育初期亦呈上升趋势,在圆桃期达到最大值,然后逐渐下降,在盛开期降到最小值。PlWDR18在黄牡丹和紫牡丹花的各个发育时期的表达量均高于PlWDR3的表达量。推测PlWDR3和PlWDR18参与黄牡丹花色形成的调控,为今后深入探讨黄牡丹花色形成机制奠定基础。

黄牡丹的大小孢子发生及雌雄配子体发育

以黄牡丹为试验材料,对黄牡丹的大小孢子发生及雌雄配子体发育进行了细胞学观察,探讨了他们的发育规律及其与外部形态的相关性。结果表明:黄牡丹小孢子母细胞减数分裂过程中出现染色体桥及落后染色体等异常现象,导致了花粉的败育,正体小孢子四分体胞质分裂为同时型,呈四面体形排列,二细胞型花粉;黄牡丹的胚囊发育属蓼型,倒生胚珠,双珠被,在发育过程中出现多个大孢子母细胞;在同一朵花的发育过程中,黄牡丹的大小孢子发生与雌雄配子体发育存在着一定的时序性相关,而且他们与蕾花的形态特征之间也有着相对稳定的对应关系。

黄牡丹远缘杂交后代花粉粒特征

为揭示牡丹远缘杂交后代花粉粒的特征,测定了以肉质花盘亚组黄牡丹为母本,革质花盘亚组栽培品种‘日月锦’、‘层中笑’、‘百园红霞’等为父本的10个远缘杂交组合,共计11个亲本、25个后代的花粉畸形率和萌发率,用扫描电镜观察了花粉粒形态,同时也观察了花和叶的形态特征。结果表明:与双亲相比,杂交后代的花粉量极少,花粉粒萌发率极低,畸形率极高,畸形花粉粒扭曲、破碎或粘成团块状。25个杂交后代的花粉粒均为超长球形,具三拟孔沟,与母本黄牡丹和绝大多数父本一致;但杂交后代的花粉粒小于双亲,外壁纹饰类型受父本影响较大,为小穴状、穴状、网状和粗网状。结合前人的观察结果,25个杂交后代中15个与父本的纹饰类型一致,与母本纹饰类型一致的杂交后代仅有6个,与父母本纹饰类型均不同的杂交后代有4个。形态观察发现杂交后代具有父本的花盘革质、心皮被毛的特征,而小叶分裂程度较母本减轻但小叶裂片较母本加宽;花径则介于父母本之间。其中,心皮被毛、小叶裂片加宽可以结合花粉粒特征作为以黄牡丹为母本的远缘杂交后代的形态识别标记。

昆明西山野生黄牡丹种子休眠与萌发特性初步研究

探讨打破牡丹种子上胚轴休眠的有效方法对于保护野生牡丹种质资源具有非常重要的理论与实践意义.在不同温度条件下,用不同处理方法对昆明西山野生黄牡丹居群种子进行生根与发芽试验.结果表明:200 mg/L GA3溶液浸泡24 h、挫伤种脐处种皮和50℃温水浸种3种处理方法对黄牡丹种子胚根的生长都有促进作用,其促根生长的效果从高到低依次为200 mg/LGA3溶液浸泡>种皮挫伤>温水浸泡;GA3溶液浸泡能打破黄牡丹种子上胚轴休眠,促进生根种子提前发芽,尤其是对根长超过3 cm的种子发芽更为有效,单纯的5℃低温条件不能打破黄牡丹种子的上胚轴休眠.15℃是野生黄牡丹种子生根和发芽都比较适合的温度条件.

黄牡丹八个居群的Giemsa C-带比较研究

应用ＢＳＧ方法对黄牡丹（ Ｐａｅｏｎｉａ ｄｅｌａｖａｙｉｖａｒ．ｌｕｔｅａ ） ８ 个居群的Ｇｉｅｍｓａ Ｃ－ 带进行了比较研究。８ 个居群的所有染色体都在着丝点附近显示出了Ｃ－ 带， 所有染色体的长臂上都没有显示Ｃ－ 带， 而短臂上的Ｃ－ 带数量和位置在居群之间表现出了一定的差异。花甸坝居群的第二、第三、第四和第五对染色体显示了端带； 卓干山居群的第一、第三、第四和第五对染色体的短臂端显示了Ｃ－ 带。在所研究的８ 个居群中， 这两个居群的端部Ｃ－ 带最多。而翁水居群的短臂上没有显示Ｃ－ 带， 但第三和第五对染色体的短臂上有随体， 且第五对染色体上的随体显示出了Ｃ－ 带， 是８ 个居群中端部Ｃ－ 带最少的。土官村居群的第三、第四和第五对染色体的短臂端部显示出了Ｃ－ 带。鲁甸居群的第二和第五对染色体的短臂端部显示出了Ｃ－带， 且第一和第四对染色体各有一条染色体的短臂端部显示出了Ｃ－ 带， 表现出了异染色质的杂合性。尼西居群的第一、第三和第五对染色体的短臂上显示出了端带。西山居群和梁王居群的Ｃ－ 带式样完全相同， 第四和第五对染色体的短臂端部显示出了Ｃ－ 带。８ 个居群的Ｇｉｅｍｓａ Ｃ－ 带式样各不相同， 这种居群水平上的Ｃ－

珍稀资源——黄牡丹

介绍了黄牡丹的生物学特性,致濒原因及在园林、药用,尤其是育种方面的研究开发价值,总结了我国对黄牡丹的研究进展,存在的问题及对其育种工作的展望。

云南野生黄牡丹谷胱甘肽转移酶(GST)基因的分离及表达分析

从已构建的云南野生黄牡丹花瓣转录组数据库中得到10个与花色素转运相关的谷胱甘肽转移酶(GST)蛋白同源性高的Unigene序列,分别命名为Pl GST1-10。利用RT-PCR和RACE技术对Pl GST1-10最大阅读框(ORF)序列扩增并进行氨基酸序列比较和系统进化树分析,结果显示:Pl GST5可能与花色素转运相关,包含1个675 bp的开放阅读框,编码1个224个氨基酸的蛋白,含有2个内含子和3个外显子,属于phi型GST;其氨基酸序列与葡萄Vv GST4、矮牵牛Ph An9、仙客来Ckm GST3、拟南芥At TT19、瓜叶菊Sc GST3和香石竹Dc GSTF2等花色素转运GST具有较高的相似性。Pl GST5在不同花色的花发育时期及盛开期的不同组织的qRT-PCR分析表明Pl GST5在花色素积累较多的组织中高丰度表达,在黄牡丹和紫牡丹的盛开期表达量最高,而在牡丹品种‘赵粉’和‘玉板白’的花发育早期表达量最高。推测Pl GST5参与黄牡丹花色素转运。

黄牡丹表型变异及多样性研究

通过对不同地理种源的黄牡丹株丛的12个形态指标进行观测,据此研究形态的变异及表型多样性,结果显示:花部形态变异较叶部大,在7个数量性状指标中,萼片的变异系数最大,为0.252 2,其次为心皮和苞片;多样性指数最高的依次是花色、瓣尖形状和瓣基斑块。3个叶形态指标中,裂叶宽度的变异系数最高,为0.160 3;在12个指标中,特征向量绝对值较大的3个性状依次为花色、瓣基斑块、苞片,反映出它们对黄牡丹表型变异的贡献率最大;而采用欧氏距离聚类可将22株系分为3大类,可用花色、斑块形态和苞片数量三个性状初区分开黄牡丹的类群,不同类群的黄牡丹的亲缘关系可依据地理种源的远近、花色、斑块色形和萼片和苞片总数进行初步分类。

黄牡丹种子浸提液对白菜种子萌发及幼苗抗氧化酶活性的影响

研究黄牡丹种子浸提液对白菜(Brassica pekinensis)种子萌发、幼苗生长及几种主要抗氧化酶活性的影响,初步探讨黄牡丹种子休眠的原因。以野生黄牡丹(Paeonia delavay Franch.var.lutea)种子为实验材料,提取种皮、胚乳水浸提物。黄牡丹种皮、胚乳中均含有抑制白菜种子萌发及幼苗生长的物质,且对白菜种子萌发及幼苗生长的抑制作用随着该物质浓度的增加而更为显著;相比种皮浸提液,相同浓度条件下的胚乳浸提液对白菜种子萌发及幼苗生长的抑制作用更加明显。几种主要抗氧化酶中,胚乳浸提液能够直接抑制白菜幼苗POD和CAT酶活性,间接影响SOD酶活性。黄牡丹种子浸提物可能通过影响白菜种子抗氧化酶活性从而影响其幼苗的正常生长,黄牡丹种子内存在抑制物质,从而影响黄牡丹种子的休眠。

HPLC法测定黄牡丹不同部位中没食子酸和丹皮酚的含量

目的建立黄牡丹中活性成分没食子酸和丹皮酚的含量测定方法,并考察黄牡丹不同部位中没食子酸和丹皮酚的含量差异。方法采用高效液相色谱（HPLC）法,Agilent TC-C18柱（4.6 mm×150 mm,5μm）;流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液,梯度洗脱：0 min→25 min→45 min,乙腈0%→24%→36%,流速为0.8 m L·min-1;检测波长为274 nm;柱温为30℃。结果没食子酸、丹皮酚线性范围分别为0.10～2.00μg（r=0.999 8,n=6）、0.005 2～0.104 0μg（r=1.000 0,n=6）,平均回收率（n=9）分别为102.16%（RSD=2.51%）、97.61%（RSD=1.34%）。没食子酸在不同部位的含量分布为果实〉叶〉皮部〉栓皮〉木部〉茎;丹皮酚在不同部位的含量分布为栓皮〉皮部〉木部〉茎,果实、叶中未检出。结论该方法准确、简捷,为黄牡丹药材提供更合理、可靠的质量控制方法。

黄牡丹花粉和植株形态性状关联性的研究

通过对6个不同居群的黄牡丹花粉形态进行扫描。结果显示,花粉形态具有多样性,花粉外壁纹饰有脑纹网状、皱波网纹状、粗网状、网状和穴状细网5种;花粉粒的变幅为(32.94-48.87)μm×(21.57-29.70)μm,居群花粉在极轴、赤道轴和极赤比都存在显著差异。通过对6个花粉形态指标和植株11个外部形态指标进行相关性分析。结果表明,花粉极轴与叶长宽比、极赤比与叶长宽比呈明显正相关,花粉极轴与叶长柄比、极赤比与叶长柄比呈明显负相关;花粉外壁纹饰变化与花瓣数量、宿存花萼和苞片数量呈显著相关。依据花粉外壁纹饰的演化规律可推测,花瓣数少、宿存萼片少,苞片数多、叶长宽比越大、叶长柄比越小应是植株较进化的特征。

西藏黄牡丹授粉前后转录组测序和生物信息学分析

采用Illumina Hiseq2000高通量测序技术对西藏黄牡丹授粉前后花蕾转录组测序,运用生物信息学分析基因表达谱研究和差异表达基因功能预测,以期了解西藏黄牡丹授粉前后花蕾生长发育分子机理,并为西藏黄牡丹的基因水平研究奠定基础。结果表明:对过滤得到的高质量序列进行拼装授粉前(A2-1)和授粉后(A3-1)平均得到了45453条和53742条unigenes,GC含量分别为41.64%和41.98%,Unigenes的平均长度为822bp和722bp。两个样品之间差异表达的上调基因有11321个,差异表达的下调基因有5585个。其中13288个差异表达基因(DGEs)分别注释到GO数据库,分别涉及到细胞组成成份(cellular component),生物学过程(biological process)和分子功能(molecular function)三大功能。KEGG数据库成功注释9842个DEGs,占总DEGs的58.22%。共涉及Cellular Processes(细胞过程)、Environmental Information Processing(环境信息处理)、Genetic Information Processing(遗传信息处理)、Human Diseases(人类疾病)、Metabolism(代谢)、Organismal Systems(生物系统)等6个大的功能类别。本研究首次对西藏黄牡丹转录组进行了分析,为黄牡丹的分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据来源。

黄牡丹花粉母细胞减数分裂过程的细胞遗传学观察

对黄牡丹花粉母细胞的减数分裂过程进行了全面的观察,发现在其减数分裂中存在诸如单价体、四价体、多价体、同源染色体联会不分离,后期Ⅰ～Ⅱ染色体桥及染色体断片、落后染色体、微核等一系列异常现象.统计了异常现象出现的频率;从细胞遗传学水平上分析了黄牡丹在野外结实率低与花粉母细胞减数分裂异常的关系.

黄牡丹的核型分析

本文对黄牡丹进行了核型分析。其染色体数目和核型公式为:K(2n)=10=6m(2SAT)+2sm+2st(SAT),其中在第3和第5对染色体的短臂上具有微型随体。并与已报道的野牡丹、紫斑牡丹和矮牡丹的核型分析资料进行了比较,对它们的关系进行了初步探讨。