‘凤丹’牡丹PoKAS基因的克隆及表达分析

为探究‘凤丹’牡丹(Paeonia ostii‘Feng Dan’)PoKAS基因在脂肪酸合成中的功能,从转录组数据中获得3个PoKAS基因,克隆基因全长并进行生物信息学分析,通过qRT-PCR检测它们在牡丹落花后第23、45、75、100和125天时的表达。结果显示:(1)克隆得到的3个基因序列全长分别为1 401、1 692和1 215 bp,分别编码466、563和404 aa;保守结构域分析发现,它们都含有KAS保守结构域,属于cond-enzymes超蛋白家族。(2)系统进化树将三者分为三大类,表明其在进化上相对独立,分别命名为PoKASⅠ、PoKASⅡ和PoKASⅢ(GenBank登录号分别为OP056413、OP056412和OP056414)。(3)qRT-PCR分析发现,在牡丹落花后种子发育的5个时期中,PoKASⅠ和PoKASⅡ基因在落花后75 d和45 d时的表达量分别显著高于其他发育时期;PoKASⅢ基因在落花后45~125 d时的表达量均显著高于落花后23 d,说明PoKASⅢ基因在牡丹种子脂肪酸合成的整个过程中发挥着重要作用,而PoKASⅡ基因主要在种子油脂快速累积前期发挥作用。研究推测,该基因家族在‘凤丹’牡丹种子脂肪酸形成过程中的不同发育时期发挥不同的作用。

以‘凤丹白’为母本的杂交及其育种潜力分析

对药用和油用牡丹品种‘凤丹白’自交亲和性进行验证的同时,对其育性以及育种潜力进行研究。分别于2008年、2009年、2011年以‘凤丹白’为母本与中原牡丹、日本牡丹以及紫斑牡丹进行了大量杂交,共设置57个杂交组合,授粉2023朵花,获得43508粒杂交种子。结果表明:1)‘凤丹白’自然授粉结实率高(19.13粒/朵),且明显高于自花授粉结实率(0.4粒/朵),属于异花授粉植物,且不存在无融合生殖现象;2)‘凤丹白’与中原牡丹、日本牡丹、紫斑牡丹杂交结实率(18.44、23.84、26.62粒/朵)均较高,表明‘凤丹白’的杂交亲和性较强;3)结实率受父本花型影响,皇冠型最低(10.42粒/朵)且与其他花型存在极显著差异,这与雄蕊高度瓣化而花粉减少且生活力下降有关;4)‘凤丹白’与‘贵妃插翠’‘黑龙锦’等39个品种杂交结实率(33.33、35.89粒/朵等)高于其自然授粉结实率,对提高油用牡丹种子产量有重要参考价值。总之,‘凤丹白’的育性强、亲和性高,是一种育种潜力巨大的优良牡丹种质资源,值得进一步挖掘与利用。

氮磷钾平衡施肥对凤丹光合特性的影响

为探究氮磷钾平衡施肥对油用牡丹光合特性的影响,建立氮磷钾平衡施肥对油用牡丹净光合速率的函数模型,模拟出油用牡丹的氮磷钾施肥最优组合方案。以油用牡丹品种凤丹为材料,采用311-A拟饱和最优回归设计,研究不同氮、磷、钾施肥处理对凤丹盛花期光合特性的影响,建立凤丹盛花期的净光合速率氮磷钾平衡施肥效应函数模型。结果表明,凤丹盛花期的净光合速率与氮磷钾肥施用量之间回归关系显著,并具有高度相关关系。所有施肥处理的净光合速率均显著高于对照,氮磷钾三因素、两因素配施对凤丹盛花期净光合速率均具有显著影响,氮磷钾3种肥料的影响作用大小顺序为钾肥>氮肥>磷肥。通过模型寻优获得最高净光合速率对应的氮磷钾最佳施肥组合为N 502.52 kg·hm-2,P2O5179.42 kg·hm-2,K2O 174.79 kg·hm-2,拟合的最大净光合速率为16.398μmol·m-2·s-1。本研究建立的施肥效应函数模型能够用于预测凤丹盛花期的光合能力,帮助改善其光合特性,对于高光效凤丹品种的生产具有重要意义。

秦岭地区‘凤丹’牡丹居群果期相关性状的表型多样性研究

为了解位于陕西境内秦岭地区的‘凤丹’牡丹居群果期相关性状的表型多样性变异,对8个居群的叶、果的8个质量性状和14个数量性状进行了系统观察。结果表明:‘凤丹’牡丹株形在居群间与居群内均存在变异,而分枝类型、新枝颜色、叶形、果实颜色等仅在居群间存在明显变异,居群内趋于一致性;数量性状上,除单果荚长度外其他均在居群间和居群内存在显著差异。8个居群间不同数量性状的平均变异系数存在一定差异,其中坐果量、单果内种子数、单果荚长度变异较大,单果荚宽度、种子径长变异较小。分析环境因素与所选性状的相关性可知,‘凤丹’牡丹的单果内种子数对纬度存在极显著的负相关,与年均温存在极显著的正相关。

凤丹种子休眠特性研究

以凤丹种子(Paeonia ostii)为试验材料,通过对凤丹种子种皮透水性、种胚形态和生活力、种子内源抑制物质活性的测定,研究凤丹种子休眠特性。结果表明:凤丹种皮降低种子吸水速度,但不影响最终吸水率,完整种子浸种56h种子吸水基本达到饱和,对凤丹种皮进行酸蚀或去皮处理不会提高萌发率,凤丹种皮不是休眠的主要原因;成熟的凤丹种子生活力达95.6%,但种胚发育不完全,其需经过一定时间的层积,种胚才能不断生长分化,完成后熟;种皮和胚乳中含有的萌发抑制物质对白菜种子和自身种子萌发有显著抑制作用,且种皮和胚乳中的抑制物含量和种类不同;300mg·L-1的外源GA3能够有效提高凤丹种子萌发率。凤丹种子休眠是由于种胚发育不完全和生理后熟以及种子内存在抑制物质引起的综合休眠。

凤丹牡丹ANS(PoANS)基因克隆、特性及表达

通过RT-PCR技术,从凤丹牡丹花瓣中克隆出编码ANS基因的c DNA序列,并对其进行生物信息学分析。对不同开花阶段的凤丹花瓣进行实时荧光定量及总花青素质量分数测定,构建原核表达载体PET-28aANS,并转化大肠杆菌BL21感受态,经IPTG诱导进行体外表达。结果表明:该序列编码区域共1 065 bp,编码354个氨基酸,其蛋白相对分子质量为40 475.5,亚细胞定位为细胞质的可能性最大;表达分析显示,ANS基因表达水平与不同开花时期的总花青素质量分数及花色相关,原核表达得到相对分子质量约为44 000的ANS-His-tag融合蛋白,与预测蛋白大小相一致。

栽植密度对‘凤丹’结实性状和产量的影响及其籽主要营养成分分析

【目的】探索油用牡丹‘凤丹’的栽培技术,提高产量,改善结实性状。【方法】以‘凤丹’2年生实生苗为材料,设置3种栽植密度(0.4 m×0.6 m、0.4 m×0.5 m、0.3 m×0.6 m),栽植4 a后,研究不同栽植密度对‘凤丹’结实性状及产量的影响,并使用气质联用色谱法对‘凤丹’籽主要脂肪酸和氨基酸成分及其含量进行测定。结实性状指标包括单果果角数、单果种籽鲜质量、鲜出籽率、单果种籽数、百粒种籽质量。【结果】‘凤丹’产量、单果种籽鲜质量、鲜出籽率、单果种籽数、百粒种籽质量等指标均随着栽植密度增加而减小。0.4 m×0.6 m栽植密度条件下,单果鲜质量为29.85 g,单果种籽鲜质量为58.330 g,单果种籽数为68.33,与0.4 m×0.5 m和0.3 m×0.6 m栽植密度处理的差异均达到极显著水平;0.4 m×0.6 m栽植密度条件下,单位面积产量达到2465.25 kg/hm2,极显著高于0.3 m×0.6 m栽植密度处理。相关性分析结果表明,‘凤丹’单位面积产量与单果果角数、鲜出籽率有极显著正相关关系,与单果种籽数、百粒种籽质量有显著正相关关系。‘凤丹’籽油不饱和脂肪酸含量为94.48%,其中亚麻酸、亚油酸、油酸含量分别为52.00%、19.84%、22.64%,饱和脂肪酸主要有棕榈酸、硬脂酸、花生酸等。‘凤丹’籽含有16种氨基酸,其中谷氨酸含量最高。【结论】‘凤丹’适宜的栽植株行距为0.4 m×0.6 m。‘凤丹’籽油含有较多的不饱和脂肪酸及丰富的氨基酸,可作为营养保健油开发利用。

‘凤丹’牡丹组织培养研究

以‘凤丹’牡丹芽为材料,对其外植体消毒、褐化防治、组培苗扩繁和生根技术进行研究。结果表明:用75%酒精消毒30s,0.1%升汞消毒8min消毒效果最佳,外植体的污染率和成活率分别为32.31%和64.32%;其最适初代诱导和继代增殖培养基为MS+6-BA 1.0mg·L^(-1)+NAA0.2mg·L^(-1)和MS+6-BA 1.0mg·L^(-1)+NAA 0.2mg·L^(-1)+PIC(毒莠定,Picloram)1.0mg·L^(-1),增殖系数为4.84;生根培养基为1/2MS+CaCl2220mg·L^(-1)+IBA 3.0mg·L^(-1)+NAA0.5mg·L^(-1),生根率为74.30%;低温结合3mg·L^(-1)硝酸银培养可使褐化率降至29.15%。

响应面法优化‘凤丹’牡丹花瓣多酚提取工艺

为优化牡丹花瓣多酚提取工艺,以‘凤丹’牡丹花瓣为试验材料,多酚含量为考察指标,研究液料比、超声时间、超声功率、乙醇体积分数四个因素对‘凤丹’牡丹花瓣多酚含量的影响。在单因素实验基础上,通过Box-Behnken实验设计方案优化多酚的最佳提取条件。结果表明,‘凤丹’牡丹花瓣多酚最佳提取工艺条件为:液料比43∶1 mL/g,超声时间30 min,超声功率72 W,乙醇体积分数63%。在此条件下,多酚含量为(52.111±1.752) mg/g,优化后的提取工艺对‘凤丹’牡丹花瓣多酚的提取有一定指导意义。

Cu和丹皮酚磺酸钠处理对凤丹根系生长、丹皮酚含量及H^+-ATPase活性的影响

采用水培法,研究了Cu单一处理及Cu与EGTA和丹皮酚磺酸钠(SPS)复合处理对凤丹(Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’)幼苗根长、根系中Cu和丹皮酚含量的影响,并研究了Cu和SPS单一及复合处理对幼苗根系离体质膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性的影响。结果显示:经5μmol.L-1Cu处理后凤丹幼苗根长和丹皮酚含量均略高于对照但总体上差异不显著;经10、20和30μmol.L-1Cu处理后,幼苗根长和丹皮酚含量总体上均低于对照,且随Cu浓度增加和处理时间延长,降幅增大。与10μmol.L-1Cu单一处理相比,10μmol.L-1Cu-10μmol.L-1EGTA和10μmol.L-1Cu-10μmol.L-1SPS复合处理均可以使根系中Cu含量显著降低、丹皮酚含量显著提高;其中,10μmol.L-1Cu-10μmol.L-1EGTA处理组幼苗根系中Cu含量的降低幅度最大,而10μmol.L-1Cu-10μmol.L-1SPS处理组幼苗根系中丹皮酚含量的增加幅度最大且显著高于对照。与对照相比,经5、10和20μmol.L-1Cu单一处理后丹凤根系离体质膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性均降低,且随Cu浓度提高降低幅度增大;而经0.1、0.2、0.5和1.0μmol.L-1SPS单一处理总体上可使膜微囊H+-ATPase活性逐渐增加;与10μmol.L-1Cu单一处理相比,10μmol.L-1Cu与0.1、0.2和0.5μmol.L-1 SPS复合处理均可使膜微囊H+-ATPase活性提高,且H+-ATPase活性均呈现随SPS浓度提高逐渐增加的趋势。研究结果揭示:较高浓度Cu胁迫对凤丹幼苗根系生长及丹皮酚合成以及质膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性均有明显抑制作用,但添加外源丹皮酚磺酸钠对Cu胁迫伤害具有一定的缓解效应。

“凤丹”牡丹种皮多糖提取工艺的研究

以水提法提取"凤丹"牡丹种皮多糖,以料液比、提取温度、提取时间、纤维素酶用量为考察因素,以多糖得率为评价指标,采用正交实验优选工艺。单因素实验结果表明,料液比、提取温度、提取时间、纤维素酶用量的最优水平分别为1∶20、90℃、2 h、3%;正交实验结果表明多糖提取的最优提取条件组合为料液比1∶30,提取温度90℃,提取时间1.5 h,1%纤维素酶用量时,牡丹种皮多糖得率达到最大,为17.62 mg/g。

‘凤丹’牡丹叶轴多糖超声辅助提取工艺优化及抗氧化性研究

为优化超声辅助提取‘凤丹’牡丹叶轴多糖的提取工艺,并测定其多糖提取液的抗氧化性,在单因素试验的基础上,以多糖得率为指标,通过 L9(34)正交试验优化多糖提取工艺参数,并通过‘凤丹’牡丹叶轴多糖提取液对2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS]自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基的清除率来评价其抗氧化能力。结果表明,最佳提取工艺参数为超声温度60 ℃,液料比24 ∶ 1 (mL/g),超声时间40 min,超声功率200 W,在此条件下多糖得率为(11.328 8±0.525 3) mg/g;‘凤丹’牡丹叶轴多糖清除ABTS+自由基和DPPH自由基的IC50分别为19.316 7 μg/g和39.330 0 μg/g,‘凤丹’牡丹叶轴多糖具有较强的抗氧化活性,是天然抗氧化剂的良好来源。

酶解辅助乙醇提取牡丹果皮木犀草素的研究

以"凤丹"牡丹(Paeonias suffruticosa"Feng Dan")果皮为原料,采用酶解辅助乙醇提取牡丹果皮木犀草素,以木犀草素得率为评价指标,先以乙醇体积分数、浸泡时间、液料比、提取次数为考察因素,在单因素实验的基础上,利用正交实验法得出四个因素的最优组合。在此最优组合的基础上,再以酶用量、水浴时间、p H、水浴温度为考察因素,利用正交实验法得到酶解条件的最优组合。结果显示:在乙醇体积分数为60%、果皮粉末浸泡30 min、液料比为10∶1条件下提取三次,以果胶酶0.05 g·L^(-1)、水浴加热160 min、p H4.0、水浴温度55℃条件下预处理的牡丹果皮木犀草素得率最高达19.30 mg·g^(-1)。

CO_2浓度增高对盆栽牡丹品种‘凤丹白’生长及光合特性的影响

在开顶式塑料薄膜气室设施条件下,通过LI-6400便携式光合测定系统测定,研究4年生盆栽牡丹品种‘凤丹白’生长和叶片净光合速率对高CO2浓度的响应。结果表明:在各自生长环境下,处理组OTC1[(1000±100)μmol/mol CO2]和OTC2[(700±100)μmol/mol CO2]的净光合速率在整个处理期间均高于对照组CK[(400±50)μmol/mol CO2]。处理30d时日平均净光合速率,OTC1和OTC2分别比CK高125.78%、73.29%;处理60 d时,OTC1和OTC2分别比CK高135.34%、117.71%;处理90 d时,OTC1和OTC2分别比CK高261.10%、71.01%;处理120 d时,OTC1和OTC2分别比CK高239.49%、73.02%。生长量方面,处理60 d时,OTC1和OTC2的株高、单叶面积、基茎、株鲜质量、株干质量分别比CK增加8.61%、16.68%、2.56%、9.48%、9.63%和4.12%、6.35%、0.64%、5.56%、7.08%;处理120 d时,OTC1和OTC2的分别比CK增加8.41%、9.64%、2.50%、14.76%、9.20%和5.88%、12.90%、1.87%、10.52%、7.78%。CO2浓度增加,导致牡丹品种‘凤丹白’叶片气孔导度、蒸腾速率降低,水分利用率显著提高。

“凤丹”牡丹果皮多糖提取研究

以水酶法提取"凤丹"牡丹果皮多糖,以提取温度、提取液p H值、纤维素酶用量、提取时间为考察因素,以多糖得率为评价指标,采用正交试验优选工艺。正交试验结果表明多糖提取的最优提取条件组合为提取温度55℃、提取液p H 4.5、纤维素酶用量0.8%、提取时间80 min时,牡丹果皮多糖得率达到最大,为(34.196±0.379)mg/g。

‘凤丹’牡丹花色变化过程中花瓣色素及相关基因表达

针对‘凤丹’牡丹在开放过程中花色由紫红色变白的现象,以‘凤丹’5个不同开放时期的花瓣为试验材料,分别运用色差仪、高效液相色谱仪和荧光定量PCR测定花色表型、花色素成分及质量分数和花青苷合成途径中相关基因的表达,进而分析花瓣色素与花青苷合成相关基因表达之间的关系。结果表明:随着花的开放,红色大幅减退,明度变大,彩度降低;‘凤丹’花中检测出2种花青苷(芍药花素-3,5-二葡糖苷和矢车菊素-3,5-二葡糖苷)和8种单体酚。花开放过程中,总花青苷和总黄酮质量分数逐渐减少,总花青苷质量分数降低幅度更大。花青苷合成相关结构基因PAL、DFR、ANS和转录因子MYB22、bHLH1的表达模式与总花青苷质量分数的变化趋势一致,而且这些基因的表达量与总花青苷质量分数均具有极显著正相关性。研究发现,‘凤丹’花色变化的主要原因是总花青苷质量分数大量减少。PAL、DFR、ANS是参与‘凤丹’花青苷合成的关键结构基因,转录因子MYB22及bHLH1可能对结构基因DFR和ANS的表达起着重要的调控作用。

大田栽培模式下油用牡丹‘凤丹’光合、蒸腾特性研究

利用便携式光合仪测定大田栽培模式下油用牡丹‘凤丹’的光合、蒸腾特性,为其栽培管理提供理论依据。结果表明:‘凤丹’牡丹净光合速率日变化呈单峰曲线或双峰曲线,日净光合速率的最高值出现在8:00或10:00,而后呈下降趋势,18:00降到最低。4月、5月‘凤丹’牡丹净光合速率日平均值明显高于其他月份。‘凤丹’牡丹蒸腾速率呈现出明显的单峰曲线,日蒸腾速率的最高值出现在8:00—14:00,没有明显的规律性,最低值出现在18:00。6月、7月‘凤丹’牡丹蒸腾速率日平均值明显高于其他月份。气孔导度的日变化均呈典型的单峰曲线,最高值出现在8:00或10:00,18:00为全天最低值。不同月份‘凤丹’牡丹气孔导度日平均值无显著差异。

不同栽培条件下油用牡丹种子产量及含油率

为给油用牡丹生产提供理论依据,以凤丹牡丹为研究对象,连续4年定点观测了平原露地栽培、林下间作和旱薄山地露地栽培3种栽培条件下油用牡丹产量的变化情况,同时研究了不同郁闭度对林下间作的油用牡丹果实经济性状和含油率的影响,分析了影响油用牡丹产量的主要因素。结果表明:凤丹牡丹在平原露地和郁闭度0.4的女贞林下栽培,株行距0.3 m×0.6 m,栽后第4年,种子(含水量13%)单位面积产量分别为2 920.5和1 854.0 kg/hm2。凤丹牡丹在旱薄山地栽培,株行距0.5 m×0.6 m,栽后第5年,种子(含水量13%)单位面积产量2 292.0 kg/hm2。株行距为0.3 m×0.6 m或0.5 m×0.6 m时,凤丹牡丹栽后第4年即出现郁闭,牡丹植株达到郁闭后,油用牡丹种子年产量有逐年下降的趋势。露地栽培油用牡丹种子产量高于林下栽培。林下栽培时,乔木林郁闭度以0.3为最宜,乔木林郁闭度为0.6时,种植6 a的油用牡丹平均单株蓇葖果数量及平均单位面积产量分别比露地栽培下降44.96%和42.78%。不同郁闭度林下种植的油用牡丹种子含油率之间无显著差异,种子含油率范围为19.5%~21.9%。油用牡丹盛花期持续降雨会严重影响坐果率。

外源Ca^(2+)对油用牡丹凤丹白幼苗光合特性的影响

以凤丹白牡丹2年生幼苗为材料,研究钙元素对其叶片光合特性、叶绿素含量和植株生长情况的影响。结果表明,各处理凤丹白光合作用日变化曲线均呈"单峰型"。处理2即钙浓度为160mg/g时,叶片的日平均净光合速率和净光合速率峰值分别为10.60μmol(CO_2)·m^(-2)·s^(-1)和19.17,表观量子效率为0.075 1,叶绿素总含量为20.33mg/g,各指标均显著高于其他3个处理。因此160mg/g的钙浓度最有利于提高油用牡丹凤丹白的光合强度和合成有机物的能力,进而提高植株的干物质积累并促进植株生长。

“凤丹”牡丹花丝愈伤组织诱导及分化研究

以“凤丹”花丝为外植体,探究了外植体发育时期、基本培养基和植物生长调节剂(plant growth regulators,PGRs)对愈伤组织诱导、增殖和分化的影响,并对不同类型的愈伤组织进行了形态组织学观察。结果表明:花蕾直径为13~19mm时、半透明或白色的幼嫩花丝更适宜愈伤组织的诱导;愈伤组织诱导的最适培养基为SH添加2,4-D 1 mg·L-1、NAA 2 mg·L-1及BA 0.2 mg·L-1,最高诱导率和诱导量分别为99.12%和5.68 g;愈伤组织增殖的最适培养基为SH添加2,4-D 0.5 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1及BA 0.25 mg·L-1,增殖率为3.86;花丝愈伤组织根据形态结构可分为三类,Ⅰ类愈伤组织具有典型的胚性愈伤组织特征,可进一步分化产生体胚;Ⅱ类愈伤组织和Ⅲ类愈伤组织内部呈现大量维管组织分化,其中Ⅱ类愈伤组织中观察到了不定芽的分化,Ⅲ类愈伤组织未见分化。上述结果表明“凤丹”花丝具有重要再生潜力,是一种良好的新型外植体,对研究建立牡丹体外再生体系具有重要价值。