三种鳖线粒体DNA细胞色素b基因序列的比较分析

对中华鳖、砂鳖和山瑞鳖线粒体DNA细胞色素b基因进行了引物设计、PCR扩增、序列测定和PCR-PFLP(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)分析。研究结果表明中华鳖、砂鳖与山瑞鳖线粒体DNACytb基因的序列全长相同,均为1140bp,其A、C、G、T含量相似,分别为378个(33.2%)、322个(28.2%)1、22个(10.7%)、318个(27.9%)、373个(32.7%)、324个(28.4%)、124个(10.9%)、319个(28.0%)、380个(33.3%)3、30个(28.9%)、127个(11.1%)、303个(26.7%)。同源性及序列差异率分析表明:中华鳖与砂鳖b基因序列的同源性为92.3%,中华鳖、山瑞鳖的为85.0%,砂鳖、山瑞鳖的为84.1%;中华鳖与砂鳖b基因核苷酸序列间的差异率为7.7%,中华鳖、山瑞鳖间的序列差异率为15.0%,砂鳖、山瑞鳖间的序列差异率为15.9%,而中华鳖、砂鳖、山瑞鳖各自个体间的序列差异率分别为2.37%、0.88%和0.18%,种间差异显著。用内切酶酶切分析其扩增产物,结果表明:用内切酶NdeⅠ可准确鉴别砂鳖,而用内切酶BamHⅠ则可准确鉴别山瑞鳖。内切酶NdeⅠ和BamHⅠ的联用分析,可使这三种鳖在分子水平都得到明确的鉴定。从三种鳖线粒体DNACytb基因核苷酸序列的显著差异和酶切位点的变化,可以进一步证明砂鳖是不同于中华鳖的鳖属一新种。

山瑞鳖塞氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药物敏感性研究

从患致死性传染病的山瑞鳖(Palea steindachneri)组织中分离到一株细菌(YL090422),对该菌形态、生理生化特征及致病性进行分析,并用BIOLOG自动微生物鉴定系统及16S rDNA序列分析对其进行了鉴定。结果显示:该菌具有较强的致病性,且为发酵型革兰氏阴性短杆菌,无芽胞及荚膜;具有对葡萄糖、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、西蒙氏柠檬酸盐、丙二酸盐、卫茅醇、吲哚、动力等反应呈阳性,对氧化酶、赖氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶、V-P反应等呈阴性的特点。BIOLOG自动微生物鉴定系统显示该菌为塞氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)。16S rDNA序列分析得到1条长度为1464bp的核苷酸序列(GenBank登录号为GU726186),并显示该分离株与塞氏柠檬酸杆菌(C.sedlakii)的同源性达99.9%,且在系统发育树上与C.sedlakii聚为一支。鉴定结果确认菌株YL090422为塞氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)。药敏试验结果显示:该菌对供试16种抗菌药物中的阿米卡星等3种药物敏感,对头孢哌酮等3种药物中度敏感,对氨苄青霉素等10种抗生素均存在不同程度的耐药。

山瑞鳖红底板病病原菌的分离鉴定及药敏试验

【目的】了解山瑞鳖红底板病的病原菌及其对药物的敏感性,为生产中有效防治该病提供科学依据。【方法】以常规方法从患红底板病山瑞鳖的肝脏、心脏和腹水中分离病菌,人工感染确定其致病性,以API 20NE生化鉴定与16S r RNA基因序列分析相结合的方法鉴定病原菌,并采用K-B纸片扩散法进行药敏试验。【结果】从患病山瑞鳖的心脏、肝脏和腹水中分离到3株优势菌株,经鉴定均为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),与标准株ATCC 7966的亲缘关系最近,同源性达99.6%。3株病原菌对舒普深、菌必治、多粘菌素B和先锋必等4种药物均高度敏感,而对先锋霉素VI、青霉素G和氨苄青霉素等3种药物均不敏感。【结论】引起广西南宁市某养鳖场山瑞鳖红底板病的病原菌是嗜水气单胞菌,可选用舒普深、菌必治、多粘菌素B和先锋必等药物进行治疗。放养密度大、水质条件差和相互咬伤是山瑞鳖在保温越冬期间红底板病暴发性流行的诱发因子。

山瑞鳖的生物学特性及人工养殖技术

本文介绍山瑞鳖的生物学特性及人工繁殖技术,为人工养殖提供了有用的信息。

山瑞鳖产卵与孵化研究

1997年对山瑞鳖的产卵和孵化进行了研究 .结果表明 :人工养殖的山瑞鳖产卵期为每年的 5～ 8月份 ,6～ 7月份为产卵高峰期。产卵次数 1年 1次 ,每窝产卵数量 2～ 2 8只不等 ,最多出现为 11只 /窝 ,平均 11.0 2只 /窝 全年卵受精率 6 4 .77% 山瑞鳖卵平均重 9.58g 受精卵在产出 8～2 0h出现白色的受精斑点 ,并随时间的延长亮斑不断扩大 山瑞鳖卵在自然条件下孵化时 ,需时 70～ 80d ;恒温孵化时 ,随孵化温度的上升 ,孵化所需时间减少 ,积温减少 ,但在 33℃时 ,胚胎在发育早期死亡 ,无鳖孵出 孵化温度为 2 8℃时 ,孵化率最高 (95% )

山瑞鳖嗜水气单胞菌感染的诊断及防治

从患病山瑞鳖的肝脏、肺脏分离到1株细菌,对该菌的形态特征、生理生化进行分析,初步鉴定为嗜水气单胞菌。采用BioFosun-Ⅰ微生物鉴定系统对该菌进一步鉴定,结果显示为嗜水气单胞菌,可能性概率(PROB)为99%,相似性指数(SIM)和位距指数(DIS)分别为0.989和0.099。综合形态特征、生理生化特点及微生物鉴定系统鉴定结果,可将从发病山瑞鳖分离到的病原鉴定为嗜水气单胞菌。人工感染试验表明,该嗜水气单胞菌是引起山瑞鳖发病的病原且具有高度致死性;药敏试验结果则表明,该菌对头孢哌酮、阿米卡星、氧氟沙星、恩诺沙星4种药物敏感;选用头孢哌酮和恩诺沙星对病鳖进行治疗,可获得较好的治疗和控制效果,为今后山瑞鳖养殖生产中更有效地防制由该菌引起的疾病提供参考。

基于线粒体Cytb基因全序列探讨两爪鳖和山瑞鳖的系统进化关系

采用PCR方法对两爪鳖(Carettochelys insculpta)和山瑞鳖(Palea steindachneri)mtDNA的细胞色素b基因(Cytb)进行了扩增和测序,并结合GenBank中已公布的其它15种龟鳖类和两种鳄类的同源序列,进行了序列变异比较和系统发生分析.以凯门鳄和扬子鳄为外群,采用邻接(neighbor joining,NJ)法、最大简约(maximum likelihood,ML)法和最大似然(maximum parsimony,MP)法重建分子系统树.结果均支持将龟鳖目分为3支:侧颈龟科(Pelomedusidae)(非洲侧颈龟Pelomedusa subrufa),两爪鳖科(Carettochelyidae)(两爪鳖Carettochelys insculpta)和一支由其它15种现生龟鳖类组成的进化支.在这里两爪鳖科被认为可能代表一新的亚目;而山瑞鳖聚于鳖科(Trionychidae)中,与中华鳖(Pelodiscus sinensis)最先聚成一支,再依次与马来鳖(Dogania subplana)、非洲鳖(Trionyx triunguis)、印度箱鳖(Lissemys punctata)聚成一组.

山瑞鳖细菌性败血症病原菌的分离鉴定及其毒力基因检测

查明广西南宁、贵港和桂平养殖山瑞鳖细菌性败血症的病原菌及其6种毒力基因的携带情况,为有效防控山瑞鳖细菌性败血症提供参考。本研究以常规方法从患病山瑞鳖的心脏和肝脏取样、分离细菌,人工感染方法确定分离菌株的致病性,细菌鉴定采用API 20NE生化鉴定和16S rRNA分子鉴定相结合的方法进行,PCR扩增法对菌株的溶血素基因(hemolysin gene,hly)、气溶素基因(aerolysin gene,Aer)、细胞兴奋性肠毒素基因(cytotonic enterotoxin gene,Alt)、细胞毒性肠毒素基因(cytotoxic enterotoxin gene,Act)、黏附素基因(major adhesin gene,ahal)和丝氨酸蛋白酶基因(serine protease gene,ahp)6种毒力基因进行检测。结果显示,从患病山瑞鳖心脏和肝脏中共分离到4株优势菌SRB125、SRB142、SRB143和SRB345,对健康山瑞鳖的平均致死率为97.50%~100.00%,是引起山瑞鳖细菌性败血症的病原菌;生化和分子鉴定结果显示,4株分离菌均为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),与A.hydrophila L3-5(KP716701)菌株的亲缘关系最近,同源相似性均达到99.9%;6种毒力基因共包含2种毒力基因型,在4株菌株中的分布为hly^+Aer^+Alt^+Act^+ahal^+ahp^+和hly^+Aer^+Alt^+Act^+ahal^+ahp~–各2株,来源于南宁的SRB143和桂平的SRB345菌株均缺失ahp基因。

山瑞鳖的研究进展

通过对山瑞鳖当前的繁育技术、仿生态养殖技术、疾病防治技术、分子水平等研究现状进行综述,发现因受分布区域的限制,山瑞鳖的整体研究水平尚处于初级阶段,具体表现为:繁育技术较落后,仿生态养殖技术不规范,分子水平研究缺乏深度,营养学研究空白等。因此,建议在繁育技术上,通过产、学、研的联合攻关,提高山瑞鳖的产卵量、受精率、孵化率及鳖苗培育成活率,并结合分子标记辅助育种技术筛选出优良品种;在仿生态养殖上,大力推广"温室—外塘"二段式养殖模式,并通过实施标准化养殖转变病害防治思路;同时要深度挖掘山瑞鳖的保健和药用价值,进一步延长山瑞鳖产业链。

基于线粒体Cytb基因序列的山瑞鳖保种群体遗传多样性分析

为研究云南地区山瑞鳖(Palea steindachneri)保种群体遗传多样性和遗传结构。该研究基于线粒体细胞色素b(Cytb)基因,利用PCR扩增和测序技术,分析了2个云南地区山瑞鳖保种群体的单倍型分布情况、遗传距离、遗传结构和群体历史动态等,扩增得到F_(3)代群体和F_(4)代群体共45个个体的线粒体Cytb基因序列。用DNAStar和MEGA软件剪切校对后序列长度为1000bp,碱基A、T、C和G的平均含量分别为31.28%、27.19%、30.18%和11.35%。在两个群体中共检测到9种单倍型,其中F_(3)代群体有7种单倍型,F_(4)代群体有3种单倍型,单倍型间没有明显的谱系结构,亲缘关系较近。两个群体内遗传背景单一,个体间平均遗传距离较小,随着保种代数的增加群体的遗传多样性水平也在逐渐降低,近交现象明显。中性检验和核苷酸歧点分布图显示,F_(3)代群体和F_(4)代群体历史上可能经历过扩张。研究结果表明,该保种群体的群体内遗传多样性较低,在今后的保种过程中应采取不同的保种策略,避免近亲繁殖。

发酵黄芪对山瑞鳖稚鳖生长性能的影响

采用单因素试验方法,研究发酵黄芪对山瑞鳖(Palea steindachneri)稚鳖生长的影响。选用960只稚鳖,随机分为4个处理组,每个处理组3个重复,每个重复80只。以基础饲料(幼鳖粉料)为对照组,试验组分别在基础饲料中添加0.2%、0.4%、0.6%发酵黄芪,饲养60 d。结果显示:1~#、2~#、3~#试验组稚鳖的增重率、成活率均显著高于0~#对照组(P<0.05),饲料系数显著低于0~#对照组(P<0.05);试验组之间差异不显著(P>0.05),以0.4%发酵黄芪组综合效果最好,与0~#对照组比,其均末重、成活率分别提高了31.86%、8.26%,饲料系数降低了14.58%。试验结果表明:发酵黄芪能显著促进稚鳖生长、提高成活率和饲料利用率的作用。

山瑞鳖亲鳖繁殖试验

开展山瑞鳖亲鳖繁殖试验,对山瑞鳖亲鳖选择、养殖条件、日常投喂、水质管理等进行养殖试验,探索提高山瑞鳖亲鳖产卵量、受精率的繁殖技术,为山瑞鳖产业健康发展提供技术支撑。

山瑞鳖稚鳖庭院养殖技术研究

开展山瑞鳖稚鳖庭院养殖技术研究,对山瑞鳖稚鳖庭院养殖设施、养殖环境、饵料投喂、水质管理、日常管理和病害防治等进行试验研究,提高山瑞鳖稚鳖养殖技术,促进山瑞鳖产业健康发展。

山瑞鳖源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及其药敏特性分析

从患病山瑞鳖的肝脏和肺脏分离纯化到1株革兰阴性杆菌GX120222,经细菌培养特性观察和VITEK 2compact全自动微生物鉴定系统对理化特性进行鉴定,结果与肺炎克雷伯菌肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ss pneumonia）特征相符;将该菌16SrRNA基因序列（KP091888）与GenBank中的序列进行BLAST比对并构建系统发育树,结果表明其与肺炎克雷伯菌的16SrRNA基因序列同源性最高（100%）,在系统发育树上与肺炎克雷伯菌肺炎亚种的菌株聚为一簇,且与肺炎克雷伯菌肺炎亚种标准菌株ATCC43816KPPR1（CP009208）的亲缘关系最近,进一步确定菌株GX120222为肺炎克雷伯菌肺炎亚种。人工感染试验结果显示,该菌对供试的山瑞鳖有较强致病性,半数致死量（LD50）为3.8×10-7 CFU/mL;药敏试验显示,GX120222对头孢西叮、舒普深和阿米卡星敏感,对特治星中度敏感,对所测的其他26种抗菌素耐药。上述结果表明,肺炎克雷伯菌GX120222是导致此次山瑞鳖发病死亡的病原菌,且具有多重耐药性。