广州血液中心Panther核酸检测系统无效结果分析

目的:分析广州血液中心Panther核酸检测系统出现无效结果原因,以对核酸检测作出指导,提高检测效率。方法:使用Panther核酸检测系统对广州血液中心2018年8月至2019年12月共201119例标本进行病毒核酸检测,统计无效结果并进行分析。结果:Panther核酸检测系统的无效检测率为1.50%。不同标本类型的无效率比较:室内质控品(IQC)(3.41%)显著高于常规标本(1.49%)和标准品(Calibrator)(1.19%),差异具有统计学意义(P<0.01);不同无效模式在不同机器的发生频率比较:无效次数比较,三台机均以散发无效为主,差异无统计学意义(P>0.05);无效测试数比较,三台机均以成批无效为主,三台机的无效模式构成比两两比较,差异有统计学意义(P<0.01);无效列表数比较,2246号机无效列表率高,同时与2244号机相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:加强检测人员培训,实验室质量监控和风险管理,采取针对样本问题和加样故障问题的措施,可以减少核酸检测无效结果。

CRISPR/Cas系统在核酸检测中的应用和挑战

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关基因(Cas)系统是古菌和细菌适应性免疫系统,最初被发现用来进行基因编辑,近年其特异识别和切割特性以及可编程性使其在核酸和非核酸靶标检测中崭露头角。目前基于CRISPR/Cas系统的核酸检测系统主要与核酸扩增技术如PCR、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)和EXPAR等恒温扩增技术结合,以提高灵敏度;多项研究也在尝试开发基于CRISPR/Cas的无预扩增核酸检测系统;另外也有研究尝试通过生物祖体(包括适体、DNAzymes和抗原-抗体反应)特异性识别靶物质实现非核酸信号转换为核酸信号,实现基于CRISPR/Cas的蛋白质、小分子、细胞等非核酸物质的检测。但仍存在一些挑战,其中目标中痕量原始浓度的信号转换和放大是分析系统的关键挑战;其他挑战包括CRISPR/Cas存在一定背景活性,CRISPR RNA和单链DNA/单链RNA信号报告序列有降解风险等。随着技术的逐渐成熟,CRISPR/Cas系统将在生物靶标检测中发挥更大作用。本文就CRISPR/Cas系统在核酸检测这一领域的最新发展方向作一述评。

CRISPR-Cas系统在病原核酸检测中的研究进展

CRISPR-Cas系统作为原核生物获得性免疫系统,由簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成,因其识别和切割特定DNA或RNA序列,而成为分子诊断领域研究的热点。研究人员利用Cas蛋白(Cas12、Cas13、Cas14、Cas3等)结合信号放大和转化技术(荧光法、电位法、比色法、侧向流动技术等),开发了许多高灵敏度、高特异性、低成本的诊断平台,为病原核酸检测提供了新途径。本文介绍了CRISPR-Cas系统的生物学机制及分类,总结现有的基于Cas蛋白反式切割活性开发的病原核酸检测技术,描述其特点、功能和应用场景,并对该系统的未来应用前景进行展望,期望CRISPR-Cas系统成为包括核酸检测在内的多靶标的理想检测平台。

泰安地区科华二代与罗氏核酸检测系统无偿献血人群检测结果分析

目的:对泰安地区无偿献血人群用科华二代和罗氏核酸检测系统的检测结果进行分析,探讨核酸检测在血液筛查中的意义。方法:选取2022年9月-2023年2月泰安地区24215例经ELISA检测合格的无偿献血者血液标本为研究对象,并对科华二代和罗氏2套核酸筛查系统的检测数据进行统计分析。结果:2022年9月-2023年2月采集的24215例无偿献血者血液标本共检出14例反应性标本,其中13例HBVDNA反应性标本,1例HIVRNA反应性标本,0例HCVRNA反应性标本。科华二代系统检测10253例标本,拆分反应率为58.33%,NAT检测不合格率为0.068%;罗氏系统检测13962例标本,拆分反应率为53.85%,NAT检测不合格率为0.050%,两套筛查系统NAT总检测不合格率为0.058%,比较两者的拆分反应率和检测不合格率,差异均无统计学意义(P>0.05)。混样有反应性标本CT值<33组拆分反应率最高(75%,3/4),CT值≥40组拆分反应性率最低(25%,1/4),拆分有反应性的标本主要集中在CT值<37(78.57%,11/14)的组。科华二代和罗氏系统试剂平均有效利用率分别为84.68%和73.25%,均值显著性P<0.05,差异有统计学意义。2022年9月NCCL第2次室间质评,两套系统结果符合率均为100%。结论:科华二代与罗氏两套核酸检测系统各有优点,根据实际情况交替使用,使彼此的试剂有效利用率都能达到最优,并且都能在酶免无反应性标本中检测出核酸反应性标本,能有效降低经输血传播病毒的风险。

核酸检测系统检测无效原因分析

目的回顾自2016年以来,本实验室使用3种核酸检测系统检测献血者血液标本时出现的检测无效情况,分析其原因以采取措施提高核酸检测效能。方法统计Roche Cobas s201系统自2016年1-12月,Procleix Tigris系统自2016年1-9月,Procleix Panther系统2016年9月-2017年3月的检测无效测试数和类型并分析。结果 Cobas s201,Tigris和Panther系统的无效率分别为0.90%(402/44 838),4.01%(2 960/73 835)和1.34%(1 093/81741),3种检测系统的检测无效率之间差异有统计学意义(P<0.05)。各个仪器的无效率之间,除Roche Cobas s201和Panther 1404之间差异没有统计学意义,其他仪器相互之间的差异都具有统计学意义(P<0.05)。仪器故障、试剂自带校准品检测失败、操作失误、样本质量等都是造成检测无效的原因。结论仪器故障和试剂校准品检测失败等是造成无效的主要原因,检测无效结果的产生与不同的检测系统有一定相关性。

2种核酸筛查系统应用于病毒核酸检测的比较

目的通过2种不同核酸筛查系统的应用与比较,进一步探讨核酸检测(nucleic acid testing,NAT)在输血工作中的作用和意义。方法采用两种核酸筛查系统对相同数量的献血者标本进行HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA检测,对其有效拆分率和核酸阳性检出率进行统计分析,比较二者的差异性,并对部分阳性献血者进行追踪。结果罗氏核酸筛查系统和科华核酸筛查系统各检测121 019例,其中罗氏系统共检20 170个pool,混检阳性pool130个,经拆分有反应性pool 81个,反应性标本为84例,pool的混检阳性率、有效拆分率、标本阳性检出率分别为0.64%、62.31%、0.069%;上海科华核酸筛查系统共检测15 128个pool,混检阳性pool 116个,经拆分有反应性pool40个,反应性标本为42例,pool的混检阳性率、有效拆分率、标本阳性率分别为0.77%、34.48%、0.035%。对17例酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)阴性,NAT阳性的献血者追踪结果显示1例为HIV"窗口期"感染,1例为HCV"窗口期"感染,另外15例ELISA和NAT再检结果为阴性。结论罗氏筛查系统与科华筛查系统均能在酶免阴性的标本中检出一定数量的核酸阳性标本,但前者的灵敏度、特异性和NAT阳性检出率均明显高于后者。开展核酸检测能够进一步保障输血安全,但同时也存在个别的假阳性。

cobas s201核酸检测系统使用前性能验证

目的在cobas s201核酸检测系统投入使用前,验证其操作性能和检测性能是否可达到预期要求,确保检测系统性能与厂商声明的技术性能相匹配,可满足实验室的实际需求。方法通过通量测试、压力测试和试剂稳定性测试3个方面评估核酸检测系统的操作性能,通过设备间性能比对验证和分析灵敏度验证,评估检测系统的检测性能。设备间性能比对验证中分别在3台cobas s201核酸检测系统上使用6混样模式对比对血清盘进行检测,采用Kappa检验评估3套核酸检测设备检测结果的一致性;分析灵敏度验证使用cobas Taq Screen MPX 2.0检测试剂,采用WHO HIV-1、HCV和HBV标准株制备梯度浓度的分析灵敏度血清盘,对血清盘进行单人模式检测,采用Probit回归分析计算95%检出限(LOD),与试剂说明书的分析灵敏度进行比对。结果每套核酸检测系统24 h可完成1 440份标本的6混样模式检测,3套核酸检测系统在3 d压力测试运行期间均无故障发生。cobas Taq Screen MPX 2.0检测试剂室温放置24 h候仍可检测出弱阳性的HIV-1、HCV和HBV样本。在核酸检测系统间的性能比对验证中,3套核酸检测系统检测结果与血清盘一致。cobas Taq Screen MPX 2.0检测试剂HIV-1、HCV和HBV的95%检出限分别是34.58 IU/m L[(27.77-48.77)IU/m L]、16.38 IU/m L[(10.15-92.22)IU/m L]、1.32 IU/m L[(1.12-1.71)IU/m L]。结论 cobas s201核酸检测系统的通量、长时间运行下的设备状态和试剂稳定性都符合实验室需求,不同设备间不存在检测性能间的差异,检测系统的分析灵敏度与厂商声明无显著差别,可达到实际检测的需要。

两种核酸系统在无偿献血检测中的性能比较

目的分析比较科华、达安两套核酸筛查系统的核酸检测(nucleic acid testing,NAT)能力。方法运用科华、达安核酸系统对经过ELISA法检测合格的56 703例血液标本及卫生部临床检验中心(NCCL)室间质评核酸标本进行检测,对其有效拆分率和核酸阳性检出率进行统计分析。结果科华核酸筛查系统共检测31 497例,混检阳性pool数35个,经拆分阳性pool数23个,阳性标本为26例,有效拆分率、阳性检出率分别为65.71%、0.08%。达安系统共检测25 206例,混检阳性pool数58个,经拆分阳性pool数30个,阳性标本为34例,有效拆分率、标本阳性检出率分别为51.72%、0.135%。10例NCCL标本全部正确检出。结论科华、达安筛查系统均能在酶免阴性标本中检出核酸阳性标本,在检测能力上各有优势,均能较好的胜任日常的核酸检测工作。

PCR-核酸飞行时间质谱系统检测新型冠状病毒方法的建立及应用研究

背景新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全球暴发,实验室检测结果是疾病诊断的重要依据,检测方法的灵敏度和特异度是影响实验结果的关键因素,现实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)核酸检测方法是COVID-19确诊的通用方法,但其检测灵敏度有方法局限性,依赖标本病毒含量。通过对PCR-核酸飞行时间质谱检测方法的优化,从而提高对低新型冠状病毒(SARS-CoV-2)含量病例检测的灵敏度,可为现有方法做有效补充。目的应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)原理,在Clin-ToFⅡ飞行时间质谱系统上,建立PCR-核酸飞行时间质谱(PCR-TOF MS)系统检测SARS-CoV-2的方法,并评估其实际应用价值。方法2020年2—3月于上海市临床检验中心室间质评阳性样本40份、阴性样本7份,国家卫生健康委员会室间质评阳性样本41份、阴性样本33份,本实验室购买阳性质粒及稀释样本32份,健康人样本28份,空白对照超纯水5份,共186份样本作为建立PCR-TOF MS系统数据。于2020年1—2月收集安徽省内临床送检到安徽省疾病预防控制中心的疑似COVID-19患者上呼吸道样本80份(咽拭子样本55份、痰液样本25份)及健康人群样本20份(均为咽拭子样本)作为评估PCR-TOF MS系统效果的数据。建立PCR-TOF MS系统试验体系步骤,包括PCR扩增、虾碱性磷酸酶(SAP)消化、单碱基延伸和质谱检测;并基于阳性质粒优化模版量,根据186份样本检测质谱峰的信噪比(SNP)确定该方法在SARS-CoV-2检测时的判读标准。对80份疑似SARS-CoV-2样本和20份健康人群样本进行检测分析,并与实时荧光定量PCR法进行对比。结果通过对PCR-TOF MS模板条件的优化,模版量6μl时,扩增产物可获得典型的质谱峰图。建立的PCR-TOF MS反应体系可以对SARS-CoV-2核酸的开放读码框1ab(ORF1ab)基因和核壳蛋白(N)基因进行有效扩增检测。本研究PCR-TOF MS方法对临床疑似病例样本的检出率为90.00%,高于实时荧光定量PCR法的75.00%,同时,结果显示,实时荧光定量PCR法检出中含有25.00%的可疑结果,而PCR-TOF MS则无可疑结果。对于痰液和咽拭子两种样本的检出率,PCR-TOF MS法分别为100.00%和85.45%,高于荧光定量PCR法的64.00%和43.64%。阴性样本两种方法均未检出。结论通过PCR技术与飞行时间质谱技术的结合,使得检测SARS-CoV-2目标片段指数级扩大,从而提高样本的检测灵敏度。MALDI-TOF MS技术通过对离子分子量的检测分析,具有较高的准确性和特异性,同时证实了痰液样本优于咽拭子样本。该方法可作为实时荧光定量PCR法的补充和协同,在一定程度上有利于弥补假阴性的问题,从而降低临床漏诊率,提高检测效率,为疫情的研判缩短时间。

血站核酸检测实验室平面规划设计与系统优化

目的探讨血站病毒核酸检测实验室科学合理的平面规划设计及各系统的优化,以提高核酸检测的能力和稳定性。方法依据一系列规范要求,按照血站核酸检测实验室的功能定位,结合具体的环境条件,确定设计思路并进行整体设计;然后对通风、空调、给排水、能源、环保、信息及安全等实验室系统进行优化。结果设计建设出了布局科学,分区合理,安全高效,实用性强且人性化的核酸检测实验室。结论作为实施和发展核酸检测的基本条件,血站病毒核酸检测实验室的科学规划设计可促进提升核酸检测服务能力和实验室管理水平。

核酸检测系统应用于血站血液筛查的使用前确认

目的回顾性分析华益美核酸检测(nucleic acid technology,NAT)系统应用于血站实验室血液筛查的使用前确认的内容和方法,为采供血单位顺利开展核酸检测提供参考。方法按照《血站质量管理规范》、《血站实验室质量管理规范》及《血站核酸检测实验室质量保证指南》的要求进行使用前确认,主要包括检测设备的安装、运行、性能确认,实验人员资质和能力、试剂性能、核酸实验室质量体系文件、信息系统的确认,以及标本处置和风险评估等方面。结果通过对华益美核酸检测系统使用前的确认,为后续NAT有效、平稳开展提供了文件化的证据,提高了血站实验室核酸检测的工作质量。结论有效开展核酸检测系统使用前确认活动是常规核酸检测的前提,是降低实际运行过程中风险的有效手段。

不同核酸检测系统常用性能监控指标比较

目的通过对3家核酸检测(NAT)系统常用关键性能监控指标的回顾性比较和分析,为血站NAT系统的评价和选择提供支持。方法对2015年1月—2019年3月核酸检测情况和3家NAT系统的混检/联检阳性率、拆分/鉴别阳性率、无效结果率、试剂使用率等常用性能监控指标进行统计分析比较。结果 2015年1月—2019年3月间共检测核酸标本496 795份,单核酸阳性(酶免阴性NAT阳性)率0.13%。3家NAT系统单核酸阳性率分别为0.06%、0.09%、0.23%;拆分/鉴别阳性率分别为66.74%、55.43%、57.82%;无效结果率分别为1.18%、1.13%、3.06%;试剂使用率分别为141.61%、152.59%、125.15%;除2家混样NAT系统的无效结果率和拆分阳性率差异无统计学意义外,其余指标各系统两两比较差异均有统计学意义。结论核酸检测能进一步提高血液安全,但不同NAT系统检测能力存在差异,各血站应结合实际情况评价和选择适合的NAT系统。

建立监测核酸检测系统趋势变化方法的探讨

目的探讨罗氏核酸检测试剂在多台核酸检测设备应用时建立室内质量控制措施,监测核酸检测设备试验的稳定性。方法应用罗氏核酸检测试剂在罗氏Cobas S201核酸检测系统上对无偿献血标本、核酸检测试剂盒阳性对照品、核酸弱阳性室内质控品进行检测,记录每台检测设备的阳性对照品和弱阳性室内质控品的各检测项目通道的Ct值。应用Excel绘制质量控制图,以检测日期为横坐标,各个项目检测Ct值为纵坐标,形成每台检测设备的各检测项目的质控分析图,通过对各检测设备阳性对照品和弱阳性室内质控品的Ct值标准差、均值,评价各检测设备检测的稳定性。结果各检测设备的阳性对照品及室内质控品的CV值均在5%以内,1A检测设备与1B检测设备比较时,各检测项目P>0.05,1B检测设备与2号检测设备比较时,各检测项目P>0.05,1A检测设备与2号检测设备比较时,各检测项目P>0.05,均无显著性差异。结论各检测设备间检测性能无明显差异,本实验室参照定量数据模式所建立的室内质量控制措施用以监测核酸检测系统趋势变化的方法具有一定的意义。

比较两种核酸检测系统检测能力的结果分析

目的分析比较罗氏和诺华核酸试剂的核酸检测(NAT)能力。方法同时运用罗氏和诺华系统对262例无偿献血者血液标本及10例卫生部室间质评(NCCL)核酸标本进行检测,统计分析比较阳性检测率。结果 245例酶联免疫吸附实验(ELISA)检测阴性的献血者标本中,罗氏和诺华系统分别检出1例和4例NAT阳性,其中仅有诺华1例鉴别实验鉴别为HBV,其余均未能鉴别;17例ELISA检测阳性的标本中,运用罗氏系统检测,11例HBs Ag阳性的标本检出5例NAT阳性,5例抗-HCV阳性的标本检出3例,1例抗-HIV阳性的标本未检出,10例NCCL标本全部正确检出;运用诺华系统检测,上述ELISA阳性标本分别检出3例、3例和0例,NCCL标本也全部正确检出。结论两种核酸检测系统在检测能力上各有优势,均能较好地胜任日常的检测工作。

基于EWMA质控图和泊松分布的核酸检测系统稳定性预警机制的建立

目的建立Procleix TIGRIS联检的稳定性预警机制,用以监测日常检测工作的稳定性。方法收集2017年1月—12月Procleix TIGRIS核酸检测系统外部质控品的HIV/HCV/HBV联检S/CO值。对数据进行正态分布检验,判断是否可以使用基于数据正态分布的统计学质量控制方法。应用指数加权移动平均(EWMA)质控图对外部质控品检测S/CO值进行分析,验证该方法对核酸检测稳定性的预警作用。使用泊松分布公式对核酸检测中反应性样本的检出率进行计算,建立阳性率异常的早期预警。结果HIV、HCV和HBV外部质控品联检S/CO值均不符合正态分布。EWMA质控图对外部质控品核酸联检S/CO值的波动敏感,可显示出不同试剂批号间的微小系统性差别。当阳性检出率在4.9‰时,169例标本中反应性标本数目>3的概率为1.02%,500例标本中反应性标本数目>5的概率为3.88%,均属于小概率事件,可根据此计算结果建立核酸联检反应性标本数目异常界限。结论应用EWMA质控图和泊松分布可建立核酸联检的早期预警机制,利于加强核酸日常检测过程的稳定性监控。

凝胶成像系统对核酸扩增产物的定量检测

目的 建立一种PCR-凝胶成像系统定量分析核酸扩增产物的方法．方法：1．用PCR荧光定量分析仪实时监测PCR扩增曲线，并选择合适的扩增循环次数，2．将梯度标准血清(10^1～10^6拷贝／u1)分别进行40，35及32次循环次数的扩增，在琼脂糖电泳，EB染色后，进行凝胶分析；3．选择凝胶分析软件中能客观反映核酸实际含量的最适参数，制定标准曲线。结果:40及35次循环时，在10^1～10^4拷贝／ul，线性良好，而在10^4，10^5及10^6拷贝／ul三个梯度时直线上升缓慢，趋于平坦；32次循环时，10拷贝／ul未能检出，10^2～10^6拷贝／ul的5个梯度的模板(对数值)与产物(体积)有良好的线性关系(r=0．97)。结论：32次循环线性范围较广，为最适循环次数；在UVIband的光密度定量分析指标中，以体积或体积百分比作为定量指标较好；本法除可用于常规PCR产物定量(HBV-DNA，TB—DNA)，也适用于RT-PCR(HCV-RNA)。

枝状核酸信号放大定量检测系统

血液中病原体的有效定性与其相关成分的定量检测可为病毒性疾病的感染及预后判断提供可靠的指标。聚合酶链反应灵敏度较高,但易受污染,且尚无较可靠、简便的定量方法;枝状核酸信号放大检测系统则无论在定性还是在定量方面都有新的突破。本文就枝状核酸信号放大系统检测方法的建立与发展、应用以及优劣之处予以简述。

一种核酸筛查系统在无偿献血检测中的应用价值

目的分析2018年10月至2019年5月浩源核酸筛查系统运行以来的检测数据,评估该系统在无偿献血核酸检测(NAT)中的应用价值。方法根据浩源核酸筛查系统运行情况、献血者标本检测数据及2019年卫健委临床检验中心(NCCL)、中国国际输血感染预防和控制(CITIC)核酸检测室间质评样本的反馈结果进行统计分析。结果浩源核酸筛查系统共检测57434例标本,混检阳性pools数69个,其中34个pools拆出阳性标本,阳性标本共37例(其中3个pools各检出2个标本),有效拆分率、阳性检出率分别为49.28%(34/69)、0.06%(37/57434)。运行期间设备故障6次,无效pools 59个,31例阳性标本的复检符合率为87.1%(27/31)。10个NCCL标本检测结果与反馈结果一致,15个CITIC标本中有3个低浓度HBV DNA标本初次检测未检出核酸,再次检测为反应性。结论浩源筛查系统能在酶免阴性标本中检出核酸阳性标本,进一步保障血液安全,对检测过程中存在的问题及时分析和整改,有助于进一步提高检测效率。

高海拔地区血液筛查核酸检测系统性能验证结果评价

目的 对西藏那曲地区(高海拔)的血液筛查核酸检测系统进行性能验证,以评估高海拔地区核酸检测的能力,进一步提升血液安全水平。方法 采用多种方法对核酸检测系统的分析灵敏度、重复性、防交叉污染能力以及不同系统间的比对等进行评估。结果 西藏那曲地区核酸检测系统对高浓度的HBV DNA和HIV-1 RNA标本的检出率均达到100%,中浓度标本的检出率超过90%;PROBIT分析结果显示,在HBV DNA和HIV-1 RNA的最低检出限(LOD)分别为8.29 IU/mL(95%CI, 5.88~20.55 IU/mL)和40.52 IU/mL (95%CI, 30.26~85.92 IU/mL),HCV RNA 2a型97.14 IU/mL (95%CI, 71.00~182.67 IU/mL),均低于说明书声明的最低检出浓度。在重复性分析中,系统的重复性达到100%。交叉污染性能验证结果显示,系统具有良好的抗交叉污染能力。通过对HBV DNA低浓度标本的重复检测和低海拔地区的多系统检测结果比对,检测结果的一致性分别为77.78%(14/18)和77.27%(17/22),结果显示那曲地区核酸检测系统与其他系统存在一定的差异。结论 该核酸检测系统在高海拔地区的血液筛查中表现出良好的性能。高海拔地区血液筛查核酸检测系统性能验证方面的研究结果与低海拔地区基本一致,为提升高海拔地区血液安全提供了可靠依据。

信号放大系统的原理及在病毒核酸检测中的应用

在病毒性疾病诊断中 ,核酸检测是最直接、最确切的手段。对难于分离培养 ,或不易用免疫学方法检测特异性抗原、抗体的病毒 ,更为重要。但单纯核酸探针的敏感性不高 ,为提高检测敏感性 ,有两种主要途径 :1模板扩增技术 ,它通过扩增靶序列来提高敏感性 ;2信号放大系统 ,它通过放大杂交后信号强度来提高敏感性。它反应迅速 ,简便易行 ,没有模板扩增的干扰因素 ,近年来在核酸检测越来越受到重视。常用的信号放大系统有分支 DNA探针 ,3DNA树状体 ,DNA标记脂质体等 。